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Exposition von Proteinen auf der Oberfläche von Escherichia coli Zellen: mechanistische Betrachtung und biotechnologische Anwendung

Exposition of proteins on the surface of Escherichia coli cells: mechanistic consideration and biotechnological application

by Alexander Wentzel
Doctoral thesis
Date of Examination:2003-05-07
Date of issue:2003-12-10
Advisor:PD Dr. Harald Kolmar
Referee:PD Dr. Wilfried Kramer
Referee:Prof. Dr. Frank Mayer
Referee:Prof. Dr. Dietrich Gradmann
crossref-logoPersistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-1402

 

 

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Name:wentzel.pdf
Size:4.94Mb
Format:PDF
Description:Dissertation
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Abstract

English

Methods of molecular evolution play an important role for the optimization of biomolecules with respect to function, stability, or interaction. A key aspect is the generation of protein variants in microbial hosts and their screening for the desired characteristics. In this thesis a method for the display of peptides and proteins on the surface of Escherichia coli bacteria via linkage to the outer membrane protein EaeA (intimin) from enterohemorrhagic Escherichia coli is presented which allows for the efficient screening of large libraries for a desired property. Passenger domains of different size, molecular structure, folding stability, and function (human interleukin 4, calmodulin, different protein inhibitors) were investigated with respect to translocation competence across the bacterial outer membrane and the influence of chemical compounds (reducing agents, detergents) on their cell surface exposition. Based on these data, a model for the mechanism of protein translocation across the Escherichia coli outer membrane via intimin was deduced. Furthermore, it was shown that molecular repertoires of peptides and proteins can be stably maintained in E. coli and screened for specific interaction partners by intimin bacterial surface display and high-throughput fluorescence-activated cell-sorting (FACS) using directly or indirectly labelled target proteins.
Keywords: intimin; bacterial surface display; Escherichia coli; EHEC; outer membrane; secretion; protein export

Other Languages

Evolutive Methoden der Molekularbiologie spielen bei der Entwicklung von in Hinblick auf Funktion, Stabilität oder Interaktion optimierten Biomolekülen eine wichtige Rolle. Ein zentraler Aspekt ist dabei die Bereitstellung von Proteinvarianten in mikrobiellen Produzenten und deren Durchmusterung nach der gewünschten Eigenschaft. In dieser Arbeit wurde ein Verfahren entwickelt, das es erlaubt, Proteinvarianten durch Kopplung an das Membranprotein EaeA (Intimin) enterohämorrhagischer Escherichia coli auf der Oberfläche von E. coli Zellen bereitzustellen und damit einer Funktionsabfrage direkt zugänglich zu machen. Verschiedene, sich hinsichtlich Größe, Struktur und Stabilität unterscheidende Passagierproteine (u.a. humanes Interleukin 4, Calmodulin, unterschiedliche Inhibitorproteine) wurden in Bezug auf Effizienz der Translokation durch die äußere Membran und deren Abhängigkeit vom Zusatz chemischer Agenzien (Reduktionsmittel, Detergenzien) untersucht. Aus diesen Daten wurde ein Modell für die Intimin-vermittelten Translokationen von Proteinen durch die äußere Membran von Escherichia coli Zellen abgeleitet. Die biotechnologische Anwendung der Intimin-vermittelten Präsentation von Peptid-/Proteinbibliotheken auf der bakteriellen Zelloberfläche wurde in einem experimentellen Beispiel demonstriert.
Schlagwörter: Intimin; bakterielle Oberflächepräsentation; Escherichia coli; EHEC; äußere Membran; Sekretion; Proteinexport
 

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