Exposition von Proteinen auf der Oberfläche von Escherichia coli Zellen: mechanistische Betrachtung und biotechnologische Anwendung
Exposition of proteins on the surface of Escherichia coli cells: mechanistic consideration and biotechnological application
Alexander Wentzel
Doctoral thesis
Date of Examination:
2003-05-07
Date of issue:
2003-12-10
Advisor:
Kolmar, Harald PD Dr.
Referee:
Kramer, Wilfried PD Dr.
Referee:
Mayer, Frank Prof. Dr.
Referee:
Gradmann, Dietrich Prof. Dr.
Persistent Address: http://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0006-B6CC-C
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wentzel.pdf
Size:
4,9 MB
Format:
PDF
Description:
Dissertation
Abstract
English
Methods of molecular evolution play an important role for the optimization of biomolecules with respect to function, stability, or interaction. A key aspect is the generation of protein variants in microbial hosts and their screening for the desired characteristics. In this thesis a method for the display of peptides and proteins on the surface of Escherichia coli bacteria via linkage to the outer membrane protein EaeA (intimin) from enterohemorrhagic Escherichia coli is presented which allows for the efficient screening of large libraries for a desired property. Passenger domains of different size, molecular structure, folding stability, and function (human interleukin 4, calmodulin, different protein inhibitors) were investigated with respect to translocation competence across the bacterial outer membrane and the influence of chemical compounds (reducing agents, detergents) on their cell surface exposition. Based on these data, a model for the mechanism of protein translocation across the Escherichia coli outer membrane via intimin was deduced. Furthermore, it was shown that molecular repertoires of peptides and proteins can be stably maintained in E. coli and screened for specific interaction partners by intimin bacterial surface display and high-throughput fluorescence-activated cell-sorting (FACS) using directly or indirectly labelled target proteins.
Keywords: intimin; bacterial surface display; Escherichia coli; EHEC; outer membrane; secretion; protein export
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Evolutive Methoden der Molekularbiologie spielen bei
der Entwicklung von in Hinblick auf Funktion,
Stabilität oder Interaktion optimierten Biomolekülen
eine wichtige Rolle. Ein zentraler Aspekt ist dabei die
Bereitstellung von Proteinvarianten in mikrobiellen
Produzenten und deren Durchmusterung nach der
gewünschten Eigenschaft. In dieser Arbeit wurde ein
Verfahren entwickelt, das es erlaubt, Proteinvarianten
durch Kopplung an das Membranprotein EaeA (Intimin)
enterohämorrhagischer Escherichia
coli auf der Oberfläche von E. coli Zellen bereitzustellen und
damit einer Funktionsabfrage direkt zugänglich zu
machen. Verschiedene, sich hinsichtlich Größe, Struktur
und Stabilität unterscheidende Passagierproteine (u.a.
humanes Interleukin 4, Calmodulin, unterschiedliche
Inhibitorproteine) wurden in Bezug auf Effizienz der
Translokation durch die äußere Membran und deren
Abhängigkeit vom Zusatz chemischer Agenzien
(Reduktionsmittel, Detergenzien) untersucht. Aus diesen
Daten wurde ein Modell für die Intimin-vermittelten
Translokationen von Proteinen durch die äußere Membran
von Escherichia coli Zellen
abgeleitet. Die biotechnologische Anwendung der
Intimin-vermittelten Präsentation von
Peptid-/Proteinbibliotheken auf der bakteriellen
Zelloberfläche wurde in einem experimentellen Beispiel
demonstriert.
Schlagwörter: Intimin; bakterielle Oberflächepräsentation; Escherichia coli; EHEC; äußere Membran; Sekretion; Proteinexport
