Protein dynamics in the nucleus: Implications for gene expression
Proteindynamik im Zellkern: Auswirkungen auf die Genexpression
von Gabriella Ficz
Datum der mündl. Prüfung:2005-07-16
Erschienen:2005-11-08
Betreuer:Dr. Donna Arndt-Jovin
Gutachter:Prof. Dr. Herbert Jäckle
Gutachter:Prof. Dr. Hans-Joachim Fritz
Dateien
Name:ficz.pdf
Size:2.53Mb
Format:PDF
Description:Dissertation
Zusammenfassung
Englisch
Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) microscopy was used to determine the kinetic properties of Polycomb group proteins in whole living Drosophila organisms (embryos) and tissues (wing imaginal discs and salivary glands). These are the first photobleaching experiments performed in whole embryos and tissues. Polycomb group (PcG) genes are essential genes in higher eukaryotes responsible for the maintenance of the spatially distinct repression of developmentally important regulators such as the homeotic genes. Their absence, as well as overexpression, causes transformations in the axial organization of the body. Although protein complexes have been isolated in vitro, little is known about their stability or exact mechanism of repression in vivo. I determined the translational diffusion coefficients of PcG proteins, dissociation constants and residence times for complexes in vivo at different developmental stages. In polytene nuclei the rate constants suggest heterogeneity of the complexes. Computer simulations with new models for spatially distributed protein complexes were performed in systems showing both diffusion and binding equilibria and the results compared with the experimental data. I was able to determine forward and reverse rate constants for complex formation. Complexes exchanged within a period of one to ten minutes, more than an order of magnitude faster than the cell cycle time, ruling out models of repression in which access of transcription activators to the chromatin is limited and demonstrating that longterm repression primarily reflects mass-action chemical equilibria. With the help of computer programs built to simulate diffusion in boundary conditions and binding kinetics of proteins to localized binding sites in the genome I describe in detail the observed biophysical processes underlying FRAP and offer guidance for a better setup, optimization and interpretation of photobleaching experiments.
Keywords: Polycomb group proteins; FRAP; Inverse FRAP; iFRAP; Transcription; Repression; Homeotic genes
Weitere Sprachen
Mithilfe der Mikroskopietechnik "Fluorescence
Recovery After Photobleaching" (FRAP) wurden die
kinetischen Eigenschaften der Proteine der Polycomb
Gruppe in lebenden Drosophila Embryonen und
verschiedenen Geweben (Imaginalscheibe der Flügel und
Speicheldrüse) charakterisiert. Dieses sind meines
Wissens die ersten kinetischen Bleichexperimente, die
an kompletten Embryonen und lebenden Geweben
durchgeführt wurden.
Die Gene der Polycomb Gruppe (PcG) sind essentielle
Gene in höheren Eukaryoten, die für die
Aufrechterhaltung der räumlich spezifischen
Unterdrückung für die Entwicklung wichtiger
Regulatoren, wie der homeotischen Gene, nötig sind.
Deren Abwesenheit sowie deren Überexpression führt zu
Transformationen der axialen Segmente des Körpers.
Obwohl PcG Proteinkomplexe bereits ex vivo isoliert wurden, ist bisher nur
wenig über deren Stabilität und den exakten Mechanismus
der Repression in vivo
bekannt.
Ich habe den Diffusionskoeffizieten von PcG Proteinen
und deren Dissotiationskonstante und Aufenthaltszeit in
Komplexen in verschiedenen Entwicklungsstadien
bestimmen können. In polytenen Zellkernen suggerieren
die Ratenkonstanten eine Heterogenität der Komplexe.
Zum Vergleich mit den experimentellen Daten wurden
Computersimulationen mit neuartigen Modellen
durchgeführt, die die räumlich inhomogene Verteilung
der Proteine berücksichtigen.
Daraus ergaben sich Schätzungen sowohl für die vorwärts
gerichtete als auch die rückwärtige Ratenkonstante der
Komplexbildung. Der Austausch in den Komplexen
geschieht in einer Zeitspanne von einer bis zu zehn
Minuten, also etwa eine Größenordnung schneller als die
Zellzykluszeit. Dies spricht gegen Modelle der
Repression, in denen die Zugänglichkeit von
Transkriptionsaktivatoren zum Chromatin permanent
eingeschränkt wird und zeigt, dass die
Langzeitunterdrückung hauptsächlich durch das chemische
Gleichgewicht in Verbindung mit dem
Massenwirkungsgesetz erreicht wird.
Mithilfe der Computersimulation von Diffusion und
räumlich lokalisierter Bindungsstellen unter
Berücksichtigung der Randbedingungen konnte ich die
gemessenen biophysikalischen Prozesse, die dem FRAP
Experiment zugrunde liegen, genau beschreiben und
daraus einen optimierten experimentellen Ablauf und
eine quantitative Interpretation der Ergebnisse
ableiten.
Schlagwörter: Polycomb Gruppen Proteine; FRAP; Inverse FRAP; iFRAP; Transkription; Repression; homeotische Gene