Protein dynamics in the nucleus: Implications for gene expression

Abstract

Mithilfe der Mikroskopietechnik "Fluorescence Recovery After Photobleaching" (FRAP) wurden die kinetischen Eigenschaften der Proteine der Polycomb Gruppe in lebenden Drosophila Embryonen und verschiedenen Geweben (Imaginalscheibe der Flügel und Speicheldrüse) charakterisiert. Dieses sind meines Wissens die ersten kinetischen Bleichexperimente, die an kompletten Embryonen und lebenden Geweben durchgeführt wurden. Die Gene der Polycomb Gruppe (PcG) sind essentielle Gene in höheren Eukaryoten, die für die Aufrechterhaltung der räumlich spezifischen Unterdrückung für die Entwicklung wichtiger Regulatoren, wie der homeotischen Gene, nötig sind. Deren Abwesenheit sowie deren Überexpression führt zu Transformationen der axialen Segmente des Körpers. Obwohl PcG Proteinkomplexe bereits ex vivo isoliert wurden, ist bisher nur wenig über deren Stabilität und den exakten Mechanismus der Repression in vivo bekannt.

Ich habe den Diffusionskoeffizieten von PcG Proteinen und deren Dissotiationskonstante und Aufenthaltszeit in Komplexen in verschiedenen Entwicklungsstadien bestimmen können. In polytenen Zellkernen suggerieren die Ratenkonstanten eine Heterogenität der Komplexe. Zum Vergleich mit den experimentellen Daten wurden Computersimulationen mit neuartigen Modellen durchgeführt, die die räumlich inhomogene Verteilung der Proteine berücksichtigen. Daraus ergaben sich Schätzungen sowohl für die vorwärts gerichtete als auch die rückwärtige Ratenkonstante der Komplexbildung. Der Austausch in den Komplexen geschieht in einer Zeitspanne von einer bis zu zehn Minuten, also etwa eine Größenordnung schneller als die Zellzykluszeit. Dies spricht gegen Modelle der Repression, in denen die Zugänglichkeit von Transkriptionsaktivatoren zum Chromatin permanent eingeschränkt wird und zeigt, dass die Langzeitunterdrückung hauptsächlich durch das chemische Gleichgewicht in Verbindung mit dem Massenwirkungsgesetz erreicht wird. Mithilfe der Computersimulation von Diffusion und räumlich lokalisierter Bindungsstellen unter Berücksichtigung der Randbedingungen konnte ich die gemessenen biophysikalischen Prozesse, die dem FRAP Experiment zugrunde liegen, genau beschreiben und daraus einen optimierten experimentellen Ablauf und eine quantitative Interpretation der Ergebnisse ableiten.