Stability regulation of Gcn4p in Saccharomyces cerevisiae

Abstract

Die selektive schnelle Proteindegradation ist ein wichtiger Mechanismus für verschiedene biologische Ereignisse wie Zell-Zyklus-Abläufe, Signal-Transduktion und Differenzierung. Folglich hängt die Stabilität von Proteinen wie Transkriptionsfaktoren, Zyklin-abhängigen Kinasen und Zyklinen, die in diese zellulären Prozesse involviert sind, von verschiedenen Umweltveränderungen ab. Das dem JUN homologe GCN4 aus Saccharomyces cerevisiae kodiert für den globalen Schlüsselregulator eines genetischen Systems, das als die Allgemeine Kontrolle der Aminosäurebiosynthese bezeichnet wird und ist dementsprechend in der Lage, auf Aminosäuremangelbedingungen zu reagieren. Die Menge von Gcn4p wird hauptsächlich über die Kontrolle der Proteinsynthese im Zytoplasma und die Kontrolle der Proteindegradation im Kern reguliert. In gesättigten Zellen ist Gcn4p ein schwach exprimiertes und sehr instabiles Protein, wohingegen dessen Translationsrate und Stabilität als Antwort auf Aminosäuremangel ansteigt.Die Aminosäure-abhängige Gcn4p Degradation wird über dessen Phosphorylierung durch die nukleäre Zyklin-abhängige Kinase Pho85p mit dem Zyklin Pcl5p reguliert. Als initiierender Schritt der Gcn4p Stabilisierung wurde die Dissoziation dieses Kinase/Zyklin Komplexes identifiziert. Des Weiteren konnten der Zyklin-abhängige Kinase Inhibitor Pho81p und ein weiteres Pho85p-Zyklin, Pcl7p, identifiziert werden, die für die Aminosäure-abhängige Stabilisierung von Gcn4p notwendig sind. Beides sind kernlokalisierte und konstitutiv exprimierte Proteine, die nicht für die Dissoziation von Pho85p/Pcl5p unter Aminosäuremangel benötigt werden. Pho81p interagiert mit Pcl5p nur unter Gcn4p-degradierenden Bedingungen, wohingegen die Interaktion zu Pcl7p einen konstitutiven Prozess darstellt. Die Substrat-Spezifität von Pho85p für Gcn4p wird durch das instabile Zyklin Pcl5p vermittelt. Die Kontrolle der Pcl5p Lokalisierung in der Zelle wurde als potentieller, für die funktionelle Spezifität des Kinase/Zyklin Komplexes benötigter Mechanismus untersucht. Die Kernlokalisierung von Pcl5p verläuft unabhängig von Aminosäuremangelbedingungen und den Proteinen Pho85p, Gcn4p und Pho81p. Im Gegensatz dazu ist das β-Importin Kap95p als ein für den Kernimport dieses Zyklins benötigtes Protein identifiziert worden. Deletions- und Transferexperimente von Pcl5p und Pcl5p/Pho80p Chimären wurden durchgeführt, um wichtige Domänen des Zyklins zu ermitteln. Diese Untersuchungen identifizierten eine zentrale Substrat-Spezifitätsdomäne von Pcl5p gefolgt von einem C-terminalen, für die Kernlokalisierung ausreichenden Bereich dieses Zyklins.Die Aminosäuremangel-induzierte Adhäsion ist abhängig von der GCN4 Expression und dem Zelloberflächen-Flokkulin Flo11p. Um die Bedeutung der Degradation von Gcn4p für dessen transkriptionelle Aktivität zu untersuchen, wurde durch den Gcn4p Aminosäureaustausch Leu267Ser oder mittels einer PCL5 Deletion eine stabilisierte Form von Gcn4p hergestellt. In beiden Fällen ist die Aminosäuremangel-induzierte Gcn4p Aktivität beeinträchtigt und die Adhäsion bzw. FLO11 Expression durch Aminosäuremangel nicht mehr induzierbar. Das deutet darauf hin, dass Proteinabbau und transkriptionelle Aktivierung gekoppelte Prozesse in der Zelle sind.