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Molecular and cellular Mechanisms controlling Primordial Germ Cell Migration in Zebrafish

Molekulare und zelluläre Mechanismen, welche die Primordiale Keimzell-Migration im Zebrafisch kontrollieren.

by Heiko Blaser
Doctoral thesis
Date of Examination:2006-05-24
Date of issue:2006-06-27
Advisor:Prof. Dr. Erez Raz
Referee:Prof. Dr. Michael Kessel
Referee:Prof. Dr. Dr. Wolfgang Engel
Referee:Prof. Dr. Heidi Hahn
crossref-logoPersistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-1415

 

 

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Name:blaser.pdf
Size:23.0Mb
Format:PDF
Description:Dissertation
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Abstract

English

In zebrafish, primordial germ cells (PGCs) are specified early in development then migrate to the area where the gonad will form and differentiate into gametes (eggs and sperm). The chemokine SDF-1 (stromal cell derived factor 1), which is expressed by mesodermal somatic cells, is the guidance cue for the migrating germ cells that express the corresponding receptor CXCR4b.Here we describe the cloning of the regulatory upstream region of the askopos gene, fusing it to a reporter gene and to RNA elements directing stabilization and translation to the PGCs. Generating transgenic fish for this construct allowed us to monitor PGC development in live zebrafish embryos starting from the earliest stages of their development. This analysis revealed distinct phases in early PGC development. During the last phase, a transition into a migratory stage occurs as PGCs become responsive to directional cues provided by somatic cells secreting the chemokine SDF-1a. Furthermore, the transition to this stage is accompanied by a reduction in E-cadherin levels and depends on the function of the RNA binding protein Dead end as well as on de novo transcription in the zygote.Following the acquisition of motility the PGCs respond immediately to SDF-1a by active migration. In an effort to understand how the guidance signal is translated into directed migration we observed higher levels of [Ca2+]i in the leading edge of directionally migrating PGCs. Artificial manipulations of [Ca2+]i distribution lead to severe problems in germ cell polarity and migration. Such manipulated germ cells exhibit unusual protrusive activity that affects the speed of migration and result in arrival of the cells to ectopic locations within the embryo. To determine the molecular cascade downstream of Ca2+ we have analyzed the role of myosin regulatory light chain kinase (MLCK) in the process. We found that MLCK was localized to the leading edge of PGCs and its activity is important for the spatial and temporal control of protrusion extensions. Indeed, expressing activated or dominant negative forms of MLCK results in aberrant cell polarity, abnormal protrusive behaviour and drastic increase in tumbling -duration. Consistently, we could observe that the myosin regulatory light chain (MLC), is primarily activated in the leading edge of migrating PGCs. In conclusion, the increased calcium levels in the leading edge of migrating germ cells might be important to regulate MLCK activity that triggers actomyosin contraction thus promoting front protrusions to allow persistent migration.
Keywords: PGC; zebrafish; sdf; cxcr4; EMT; calcium; migration; chemotaxis; E-cadherin; transition; myosin; kinase

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Im Zebrafisch spezifizieren sich die primordialen Keimzellen schon im frühen Stadium der embryonalen Entwicklung und migrieren anschließend zur Region wo die Gonaden gebildet werden, wo sie sich schlussendlich zu Gameten (Eier oder Spermien) entwickeln. Das Chemokin SDF-1 wird von somatischen Mesoderm Zellen exprimiert und dient als Wegweiser für die migrierenden Keimzellen, die wiederum den korrespondierenden Rezeptor CXCR4b exprimieren.Hier beschreiben wir die Klonierung der Promoter-Region des Gens askopos, welche wir an ein Reporter-Gen und bestimmte RNA Elemente fusioniert haben, die wiederum zur spezifischen Stabilisierung und Translation der RNA in den Keimzellen führte. Wir benutzten dieses Konstrukt um einen transgenen Fisch zu erzeugen, welcher uns erlaubte, die Entwicklung der primordialen Keimzellen während den frühen embryonalen Entwicklungsphasen zu verfolgen. Diese Analyse offenbarte uns verschiedene Phasen der primordialen Keimzellentwicklung. Während der letzten Phase ändern die primordialen Keimzellen ihr Verhalten und beginnen zu migrieren. Erst ab dieser Phase können die Keimzellen auf das von somatischen Zellen exprimierte SDF-1a reagieren und geleitet werden. Zusätzlich detektierten wir eine Reduzierung des Proteins E-cadherin beim Eintritt in die letzte Phase der primoridalen Keimzellentwicklung. Nebenbei konnten wir auch zeigen, dass die letzte Phase von der Funktion des Dead end Proteins und von de novo Transkription abhängt.Nachdem die Keimzellen das migrieren erlernt haben, können sie sofort aktiv in Richtung SDF-1a migrieren. In dem Bestreben herauszufinden wie das Chemokin Signal von der Zelle in ausgerichtete Migration interpretiert wird, haben wir die Beobachtung gemacht, dass migrierende Keimzellen konstant hohe Kalzium Konzentrationen an der Front aufweisen. Manipulationen der Kalzium-Verteilung in der Zelle resultierten in schwerwiegenden Problemen der Zell-Polarisation und Migration. Solch manipulierte Keimzellen zeigten eine ungewöhnlich hohe Anzahl an Protrusion, was die Migrationsgeschwindigkeit so stark beeinflusste, dass viele Keimzellen in ektopischen Regionen im Embryo wieder gefunden wurden. Um die molekulare Kaskade zu ermitteln, die von Kalzium aktiviert wird, analysierten wir die Funktion von MLCK in dem Prozess der Keimzell-Migration. Wir entdeckten, dass MLCK in der Front von migrierenden primordialen Keimzellen lokalisiert und dass die Aktivität von MLCK wichtig ist für die kontrollierte Formation von Protrusion. In der Tat, bei der Expression von einer aktivierten und einer dominant negativen Form von MLCK, zeigten die Keimzellen Probleme bei der Polarisierung, der Protrusion-Formation und ein drastischer Anstieg der verbrachten Zeit in der tumbling -Phase wurde registriert. Ebenso konnten wir die Aktivierung von myosin hauptsächlich an der Front von migrierenden primordialen Keimzellen detektieren. Die erhöhte Kalziumkonzentration an der Front könnte schlussendlich wichtig sein, um die Aktivität von MLCK zu regulieren, welche andererseits die Kontraktion vom Acto-myosin Kortex auslöst, und damit die Formation von Protrusion an der Front der Zelle und beständige Migration ermöglicht.
Schlagwörter: primoridale Keimzelle; Zebrafisch; sdf; cxcr4; EMT; Kalzium; Migration; Chemotaxis; E-cadherin; Transition; Myosin; Kinase
 

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