Identification and characterization of the molecular complex formed by the P2X2 receptor subunit and the adapter protein Fe65 in rat brain
Charakterisierung der Wechselwirkungen zwischen dem P2X2 Rezeptor und dem Fe65 Adapterprotein im Rattengehirn
von Marianela Masin
Datum der mündl. Prüfung:2006-05-03
Erschienen:2006-06-29
Betreuer:PD Dr. Florentina Soto
Gutachter:Prof. Dr. Hans-Joachim Fritz
Gutachter:Prof. Dr. Herbert Jäckle
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Description:Dissertation
Zusammenfassung
Englisch
Synaptic transmission in the nervous system is achieved through the release of neurotransmitters from presynaptic terminals, resulting in the activation of neurotransmitter receptors at postsynaptic membrane. ATP is a neurotransmitter that mediates fast synaptic transmission in the central and peripheral nervous system, by activating a family of ATP-gated ionotropic receptors called P2X receptors. Mammalian P2X receptors are formed by seven subunits (P2X1 P2X7) of which mainly P2X2, P2X4 and P2X6 subunits are expressed in the brain. By using postembedding immunogold labeling combined with electron microscopy, the three subunits have been localized at the peripheral portion of the excitatory postsynaptic membrane. This precise localization of P2X subunits at excitatory synapses suggests an interaction with intracellular regulatory or anchoring proteins, as described for other synaptic receptors. However, interaction partners of P2X receptor subunits in the synapse have not been identified so far.In the present work, that question was answered by performing a yeast two-hybrid (Y2H) screening of a rat brain cDNA library employing the C-terminal domain of the P2X2 subunit as a bait. This approach allowed us to isolate the protein Fe65 as the main interacting partner of neuronal P2X2 receptor subunits. Characteristics of the interaction were confirmed in vitro by complementary Y2H assays and GST-pulldown experiments. Other members of the P2X family, as P2X4 and P2X7 were not able to interact with Fe65, revealing the specificity of the interaction. An interaction was found for P2X2 and the Fe65-related protein Fe65-like1, but was not observed between Fe65 and the naturally occurring P2X2 splice variant P2X2(b), indicating that alternative splicing may regulate complex assembly. Deletions and point mutations on both interacting partners helped to identify that the interaction is driven by the WW domain of Fe65 which specifically recognizes the proline rich sequence PPPP at the C-terminus of the P2X2 receptor.Two antibodies against Fe65 were generated, characterized and employed to assay the subcellular localization of this protein by immunogold-labeling electron microscopy. Labeling for Fe65 was found at the pre- and postsynaptic specialization of CA1 hippocampal pyramidal cell/Schaffer collateral synapses. By double immunogold labeling, the co-localization of Fe65 with P2X2 subunits at the postsynaptic specialization of excitatory synapses was observed, suggesting that the interaction occurs in vivo. As expected by the overlapping distribution of P2X2 and Fe65, both proteins could be co-immunoprecipitated from brain membrane extracts. This experiment demonstrates that both proteins are present in the same molecular complex providing more evidence on the occurrence in vivo of such association. The assembly with Fe65 was found to regulate certain functional properties of P2X2 receptors as demonstrated by electrophysiology recordings on HEK cells and Xenopus laevis oocyte heterologously expressing both proteins. While Fe65-bound P2X2 receptors showed comparable basic pharmacological properties, as current amplitudes, kinetics and ATP EC50 values, permeability changes were affected. Thus, the time- and activation-dependent change in ionic selectivity of P2X2 receptors was inhibited by coexpression with Fe65. We propose that Fe65 tethers the C-terminus of the receptor and impairs its ability permeate bulky organic cations, suggesting a novel mechanism for intracellular proteins in regulating receptor function and thus ATP-mediated synaptic transmission.
Keywords: Adapter proteins; Ionotropic receptors; P2X; Fe65; neurotransmitter; ATP; amyloid precursor protein (APP); WW domain
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Die Erregungsüberstragung an chemischen Synapsen des
Nervensystems beginnt mit der Freisetzung von
Neurotransmittermolekülen aus präsynaptischen
Nervenendigungen. Diese Transmittermoleküle aktivieren
spezifische Rezeptoren in der postsynaptischen Membran.
ATP is ein Neurotransmitter, der zur synaptischen
Übertragung im zentralen und peripheren Nervensystem
verwendet wird. Dabei bindet ATP an ionotrope
Rezeptoren in der postsynaptischen Membran. Diese
Rezeptoren nennt man P2X Rezeptoren. In Säugetieren
existieren sieben verschiedene P2X
Rezeptoruntereinheiten
(P2X1 P2X7). Von diesen sind
hauptsächlich die P2X2, P2X4 und
P2X6 Untereinheiten im Gehirn exprimiert.
Mittles goldmarkierter Antikörper konnten die
Lokalisation dieser Rezeptoren im äussere Abschnitt der
postsynaptischen Spezialisierung
elektronenmikroskopisch dargestellt werden. Diese
präzise Lokalisierung der P2X Rezeptoren legte die
Vermutung nahe, dass P2X Rezeptoren, ähnlich anderern
synaptischen Rezeptoren, mit intrazellulären
regulatorischen Proteinen interagieren. Bislang jedoch
wurden keine entsprechenden Proteine identifiziert.In der vorliegenden Arbeit wurde daher mittels der
Hefe-Zwei-Hybrid Methode eine Rattenhirn cDNA
Bibliothek mit dem Carboxyterminus der P2X2
Untereinheit nach potentiellen Interaktionspartnern
durchsucht. So gelang es das Protein Fe65 als wichtigen
neuronalen Interaktionspartner von P2X2
Rezeptoren zu identifizieren. Die Interaktion von Fe65
und P2X2 Untereinheiten wurde zunächst mit
Hefe-Zwei-Hybrid Methoden und GST-pulldown Experimenten
näher charakterisiert. Dabei zeigte sich, dass Fe65
spezifisch mit P2X2 nicht aber mit anderen
P2X Untereinheiten (z.B. P2X4 und
P2X7) oder mit einer natürlich vorkommenden
Spleissvariant von P2X2 (P2X2(b))
interagiert. Neben Fe65 konnte auch für das verwandte
Protein Fe65-like1 nachgewiesen werden, dass es an den
P2X2 Carboxyterminus bindet. Durch
Generierung von Deletionen und Punktmutationen in den
Sequenzen beider Interaktionspartner konnte weiter
gezeigt werden, dass die Bindung dieser Proteine
zwischen der WW Domäne von Fe65 und einer prolinreichen
Sequenz (PPPP) im Carboxyterminus der P2X2
Untereinheit stattfindet.Zwei Antikörper gegen Fe65 wurden generiert,
charakterisiert und zur elektronenmikroskopischen
Darstellung der subzellulären Lokalisierung von Fe65
eingesetzt. Fe65 wurde dabei in der prä- und
postsynaptischen Membran der Synapsen von Schaffer
Kollateralen und hippocampalen Pyramidenzellen
nachgewiesen. Doppelte Immunogoldmarkierung zeigte
ferner, dass P2X2 Untereinheiten und Fe65 im
äusseren Abschnitt der postsynaptischen Spezialisierung
kolokalisiert sind. Darüberhinaus gelang es beide
Proteine gemeinsam aus Membranextrakten von Hirngewebe
zu immunopräzipitieren. In der Zusammenschau lassen
diese Ergebnisse den Schluss zu das Fe65 und
P2X2 Untereinheit in vivo in
postsynaptischen Membranen des Zentralnervensystems
interagieren.Um zu untersuchen, ob die Bindung von Fe65 die
Rezeptoreigenschaften von P2X2 reguliert,
wurden elektrophysiologische Untersuchungen an HEK
Zellen und Xenopus laevis
Oozyten, die diese Proteine einzeln oder zusammen
exprimierten, durchgeführt. Während P2X2
Rezeptoren mit Fe65 ähnliche pharmakoligsche
Eigenschaften zeigten und Amplitude und Kinetik der
Ströme vergleichbar den durch P2X2
Rezeptoren ohne Fe65 vermittelten waren, zeigten sich
drastische Unterschiede bei der Permeabilität von
P2X2 Rezeptoren mit und ohne Fe65. So wurde
die zeit- und aktivierungsabhängige Änderung der
Ionenselektivität von P2X2 Rezeptoren durch
Assoziation mit Fe65 nahezu komplett unterdrückt. Dies
legt die Schlussfolgerung nahe, dass die Bindung von
Fe65 die Motilität des P2X2 Carboxyterminus
einschränkt und damit die Permeabilität dieser
Rezeptoren für grössere organische Kationen reduziert.
Dies stellt einen neuartigen Regulationsmechanismus von
ionotropen Rezeptoren und damit der ATP-vermittelten
synaptischen Erregungsübertragung im Nervensystem
dar.
Schlagwörter: Adapterprotein; ionotrope Rezeptoren; P2X; Fe65; Neurotransmitter; ATP; WW Domäne