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Identification and characterization of the molecular complex formed by the P2X2 receptor subunit and the adapter protein Fe65 in rat brain

dc.contributor.advisorSoto, Florentina PD Dr.de
dc.contributor.authorMasin, Marianelade
dc.date.accessioned2012-05-16T12:12:46Zde
dc.date.available2013-01-30T23:50:34Zde
dc.date.issued2006-06-29de
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0006-B6DE-2de
dc.identifier.urihttp://dx.doi.org/10.53846/goediss-1416
dc.description.abstractDie Erregungsüberstragung an chemischen Synapsen des Nervensystems beginnt mit der Freisetzung von Neurotransmittermolekülen aus präsynaptischen Nervenendigungen. Diese Transmittermoleküle aktivieren spezifische Rezeptoren in der postsynaptischen Membran. ATP is ein Neurotransmitter, der zur synaptischen Übertragung im zentralen und peripheren Nervensystem verwendet wird. Dabei bindet ATP an ionotrope Rezeptoren in der postsynaptischen Membran. Diese Rezeptoren nennt man P2X Rezeptoren. In Säugetieren existieren sieben verschiedene P2X Rezeptoruntereinheiten (P2X1 P2X7). Von diesen sind hauptsächlich die P2X2, P2X4 und P2X6 Untereinheiten im Gehirn exprimiert. Mittles goldmarkierter Antikörper konnten die Lokalisation dieser Rezeptoren im äussere Abschnitt der postsynaptischen Spezialisierung elektronenmikroskopisch dargestellt werden. Diese präzise Lokalisierung der P2X Rezeptoren legte die Vermutung nahe, dass P2X Rezeptoren, ähnlich anderern synaptischen Rezeptoren, mit intrazellulären regulatorischen Proteinen interagieren. Bislang jedoch wurden keine entsprechenden Proteine identifiziert.In der vorliegenden Arbeit wurde daher mittels der Hefe-Zwei-Hybrid Methode eine Rattenhirn cDNA Bibliothek mit dem Carboxyterminus der P2X2 Untereinheit nach potentiellen Interaktionspartnern durchsucht. So gelang es das Protein Fe65 als wichtigen neuronalen Interaktionspartner von P2X2 Rezeptoren zu identifizieren. Die Interaktion von Fe65 und P2X2 Untereinheiten wurde zunächst mit Hefe-Zwei-Hybrid Methoden und GST-pulldown Experimenten näher charakterisiert. Dabei zeigte sich, dass Fe65 spezifisch mit P2X2 nicht aber mit anderen P2X Untereinheiten (z.B. P2X4 und P2X7) oder mit einer natürlich vorkommenden Spleissvariant von P2X2 (P2X2(b)) interagiert. Neben Fe65 konnte auch für das verwandte Protein Fe65-like1 nachgewiesen werden, dass es an den P2X2 Carboxyterminus bindet. Durch Generierung von Deletionen und Punktmutationen in den Sequenzen beider Interaktionspartner konnte weiter gezeigt werden, dass die Bindung dieser Proteine zwischen der WW Domäne von Fe65 und einer prolinreichen Sequenz (PPPP) im Carboxyterminus der P2X2 Untereinheit stattfindet.Zwei Antikörper gegen Fe65 wurden generiert, charakterisiert und zur elektronenmikroskopischen Darstellung der subzellulären Lokalisierung von Fe65 eingesetzt. Fe65 wurde dabei in der prä- und postsynaptischen Membran der Synapsen von Schaffer Kollateralen und hippocampalen Pyramidenzellen nachgewiesen. Doppelte Immunogoldmarkierung zeigte ferner, dass P2X2 Untereinheiten und Fe65 im äusseren Abschnitt der postsynaptischen Spezialisierung kolokalisiert sind. Darüberhinaus gelang es beide Proteine gemeinsam aus Membranextrakten von Hirngewebe zu immunopräzipitieren. In der Zusammenschau lassen diese Ergebnisse den Schluss zu das Fe65 und P2X2 Untereinheit in vivo in postsynaptischen Membranen des Zentralnervensystems interagieren.Um zu untersuchen, ob die Bindung von Fe65 die Rezeptoreigenschaften von P2X2 reguliert, wurden elektrophysiologische Untersuchungen an HEK Zellen und Xenopus laevis Oozyten, die diese Proteine einzeln oder zusammen exprimierten, durchgeführt. Während P2X2 Rezeptoren mit Fe65 ähnliche pharmakoligsche Eigenschaften zeigten und Amplitude und Kinetik der Ströme vergleichbar den durch P2X2 Rezeptoren ohne Fe65 vermittelten waren, zeigten sich drastische Unterschiede bei der Permeabilität von P2X2 Rezeptoren mit und ohne Fe65. So wurde die zeit- und aktivierungsabhängige Änderung der Ionenselektivität von P2X2 Rezeptoren durch Assoziation mit Fe65 nahezu komplett unterdrückt. Dies legt die Schlussfolgerung nahe, dass die Bindung von Fe65 die Motilität des P2X2 Carboxyterminus einschränkt und damit die Permeabilität dieser Rezeptoren für grössere organische Kationen reduziert. Dies stellt einen neuartigen Regulationsmechanismus von ionotropen Rezeptoren und damit der ATP-vermittelten synaptischen Erregungsübertragung im Nervensystem dar.de
dc.format.mimetypeapplication/pdfde
dc.language.isoengde
dc.rights.urihttp://webdoc.sub.gwdg.de/diss/copyr_diss.htmlde
dc.titleIdentification and characterization of the molecular complex formed by the P2X<sub>2</sub> receptor subunit and the adapter protein Fe65 in rat brainde
dc.typedoctoralThesisde
dc.title.translatedCharakterisierung der Wechselwirkungen zwischen dem P2X<sub>2</sub> Rezeptor und dem Fe65 Adapterprotein im Rattengehirnde
dc.contributor.refereeFritz, Hans-Joachim Prof. Dr.de
dc.date.examination2006-05-03de
dc.subject.dnb500 Naturwissenschaften allgemeinde
dc.description.abstractengSynaptic transmission in the nervous system is achieved through the release of neurotransmitters from presynaptic terminals, resulting in the activation of neurotransmitter receptors at postsynaptic membrane. ATP is a neurotransmitter that mediates fast synaptic transmission in the central and peripheral nervous system, by activating a family of ATP-gated ionotropic receptors called P2X receptors. Mammalian P2X receptors are formed by seven subunits (P2X1 P2X7) of which mainly P2X2, P2X4 and P2X6 subunits are expressed in the brain. By using postembedding immunogold labeling combined with electron microscopy, the three subunits have been localized at the peripheral portion of the excitatory postsynaptic membrane. This precise localization of P2X subunits at excitatory synapses suggests an interaction with intracellular regulatory or anchoring proteins, as described for other synaptic receptors. However, interaction partners of P2X receptor subunits in the synapse have not been identified so far.In the present work, that question was answered by performing a yeast two-hybrid (Y2H) screening of a rat brain cDNA library employing the C-terminal domain of the P2X2 subunit as a bait. This approach allowed us to isolate the protein Fe65 as the main interacting partner of neuronal P2X2 receptor subunits. Characteristics of the interaction were confirmed in vitro by complementary Y2H assays and GST-pulldown experiments. Other members of the P2X family, as P2X4 and P2X7 were not able to interact with Fe65, revealing the specificity of the interaction. An interaction was found for P2X2 and the Fe65-related protein Fe65-like1, but was not observed between Fe65 and the naturally occurring P2X2 splice variant P2X2(b), indicating that alternative splicing may regulate complex assembly. Deletions and point mutations on both interacting partners helped to identify that the interaction is driven by the WW domain of Fe65 which specifically recognizes the proline rich sequence PPPP at the C-terminus of the P2X2 receptor.Two antibodies against Fe65 were generated, characterized and employed to assay the subcellular localization of this protein by immunogold-labeling electron microscopy. Labeling for Fe65 was found at the pre- and postsynaptic specialization of CA1 hippocampal pyramidal cell/Schaffer collateral synapses. By double immunogold labeling, the co-localization of Fe65 with P2X2 subunits at the postsynaptic specialization of excitatory synapses was observed, suggesting that the interaction occurs in vivo. As expected by the overlapping distribution of P2X2 and Fe65, both proteins could be co-immunoprecipitated from brain membrane extracts. This experiment demonstrates that both proteins are present in the same molecular complex providing more evidence on the occurrence in vivo of such association. The assembly with Fe65 was found to regulate certain functional properties of P2X2 receptors as demonstrated by electrophysiology recordings on HEK cells and Xenopus laevis oocyte heterologously expressing both proteins. While Fe65-bound P2X2 receptors showed comparable basic pharmacological properties, as current amplitudes, kinetics and ATP EC50 values, permeability changes were affected. Thus, the time- and activation-dependent change in ionic selectivity of P2X2 receptors was inhibited by coexpression with Fe65. We propose that Fe65 tethers the C-terminus of the receptor and impairs its ability permeate bulky organic cations, suggesting a novel mechanism for intracellular proteins in regulating receptor function and thus ATP-mediated synaptic transmission.de
dc.contributor.coRefereeJäckle, Herbert Prof. Dr.de
dc.subject.topicMathematics and Computer Sciencede
dc.subject.gerAdapterproteinde
dc.subject.gerionotrope Rezeptorende
dc.subject.gerP2Xde
dc.subject.gerFe65de
dc.subject.gerNeurotransmitterde
dc.subject.gerATPde
dc.subject.gerWW Domänede
dc.subject.engAdapter proteinsde
dc.subject.engIonotropic receptorsde
dc.subject.engP2Xde
dc.subject.engFe65de
dc.subject.engneurotransmitterde
dc.subject.engATPde
dc.subject.engamyloid precursor protein (APP)de
dc.subject.engWW domainde
dc.subject.bk42.13de
dc.identifier.urnurn:nbn:de:gbv:7-webdoc-756-4de
dc.identifier.purlwebdoc-756de
dc.affiliation.instituteMedizinische Fakultätde
dc.subject.gokfullWA 000: Biologiede
dc.subject.gokfullWF 200: Molekularbiologiede
dc.identifier.ppn515115339de


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