dc.contributor.advisor | Soto, Florentina PD Dr. | de |
dc.contributor.author | Masin, Marianela | de |
dc.date.accessioned | 2012-05-16T12:12:46Z | de |
dc.date.available | 2013-01-30T23:50:34Z | de |
dc.date.issued | 2006-06-29 | de |
dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0006-B6DE-2 | de |
dc.identifier.uri | http://dx.doi.org/10.53846/goediss-1416 | |
dc.description.abstract | Die Erregungsüberstragung an chemischen Synapsen des
Nervensystems beginnt mit der Freisetzung von
Neurotransmittermolekülen aus präsynaptischen
Nervenendigungen. Diese Transmittermoleküle aktivieren
spezifische Rezeptoren in der postsynaptischen Membran.
ATP is ein Neurotransmitter, der zur synaptischen
Übertragung im zentralen und peripheren Nervensystem
verwendet wird. Dabei bindet ATP an ionotrope
Rezeptoren in der postsynaptischen Membran. Diese
Rezeptoren nennt man P2X Rezeptoren. In Säugetieren
existieren sieben verschiedene P2X
Rezeptoruntereinheiten
(P2X1 P2X7). Von diesen sind
hauptsächlich die P2X2, P2X4 und
P2X6 Untereinheiten im Gehirn exprimiert.
Mittles goldmarkierter Antikörper konnten die
Lokalisation dieser Rezeptoren im äussere Abschnitt der
postsynaptischen Spezialisierung
elektronenmikroskopisch dargestellt werden. Diese
präzise Lokalisierung der P2X Rezeptoren legte die
Vermutung nahe, dass P2X Rezeptoren, ähnlich anderern
synaptischen Rezeptoren, mit intrazellulären
regulatorischen Proteinen interagieren. Bislang jedoch
wurden keine entsprechenden Proteine identifiziert.In der vorliegenden Arbeit wurde daher mittels der
Hefe-Zwei-Hybrid Methode eine Rattenhirn cDNA
Bibliothek mit dem Carboxyterminus der P2X2
Untereinheit nach potentiellen Interaktionspartnern
durchsucht. So gelang es das Protein Fe65 als wichtigen
neuronalen Interaktionspartner von P2X2
Rezeptoren zu identifizieren. Die Interaktion von Fe65
und P2X2 Untereinheiten wurde zunächst mit
Hefe-Zwei-Hybrid Methoden und GST-pulldown Experimenten
näher charakterisiert. Dabei zeigte sich, dass Fe65
spezifisch mit P2X2 nicht aber mit anderen
P2X Untereinheiten (z.B. P2X4 und
P2X7) oder mit einer natürlich vorkommenden
Spleissvariant von P2X2 (P2X2(b))
interagiert. Neben Fe65 konnte auch für das verwandte
Protein Fe65-like1 nachgewiesen werden, dass es an den
P2X2 Carboxyterminus bindet. Durch
Generierung von Deletionen und Punktmutationen in den
Sequenzen beider Interaktionspartner konnte weiter
gezeigt werden, dass die Bindung dieser Proteine
zwischen der WW Domäne von Fe65 und einer prolinreichen
Sequenz (PPPP) im Carboxyterminus der P2X2
Untereinheit stattfindet.Zwei Antikörper gegen Fe65 wurden generiert,
charakterisiert und zur elektronenmikroskopischen
Darstellung der subzellulären Lokalisierung von Fe65
eingesetzt. Fe65 wurde dabei in der prä- und
postsynaptischen Membran der Synapsen von Schaffer
Kollateralen und hippocampalen Pyramidenzellen
nachgewiesen. Doppelte Immunogoldmarkierung zeigte
ferner, dass P2X2 Untereinheiten und Fe65 im
äusseren Abschnitt der postsynaptischen Spezialisierung
kolokalisiert sind. Darüberhinaus gelang es beide
Proteine gemeinsam aus Membranextrakten von Hirngewebe
zu immunopräzipitieren. In der Zusammenschau lassen
diese Ergebnisse den Schluss zu das Fe65 und
P2X2 Untereinheit in vivo in
postsynaptischen Membranen des Zentralnervensystems
interagieren.Um zu untersuchen, ob die Bindung von Fe65 die
Rezeptoreigenschaften von P2X2 reguliert,
wurden elektrophysiologische Untersuchungen an HEK
Zellen und Xenopus laevis
Oozyten, die diese Proteine einzeln oder zusammen
exprimierten, durchgeführt. Während P2X2
Rezeptoren mit Fe65 ähnliche pharmakoligsche
Eigenschaften zeigten und Amplitude und Kinetik der
Ströme vergleichbar den durch P2X2
Rezeptoren ohne Fe65 vermittelten waren, zeigten sich
drastische Unterschiede bei der Permeabilität von
P2X2 Rezeptoren mit und ohne Fe65. So wurde
die zeit- und aktivierungsabhängige Änderung der
Ionenselektivität von P2X2 Rezeptoren durch
Assoziation mit Fe65 nahezu komplett unterdrückt. Dies
legt die Schlussfolgerung nahe, dass die Bindung von
Fe65 die Motilität des P2X2 Carboxyterminus
einschränkt und damit die Permeabilität dieser
Rezeptoren für grössere organische Kationen reduziert.
Dies stellt einen neuartigen Regulationsmechanismus von
ionotropen Rezeptoren und damit der ATP-vermittelten
synaptischen Erregungsübertragung im Nervensystem
dar. | de |
dc.format.mimetype | application/pdf | de |
dc.language.iso | eng | de |
dc.rights.uri | http://webdoc.sub.gwdg.de/diss/copyr_diss.html | de |
dc.title | Identification and characterization of the molecular complex formed by the P2X<sub>2</sub> receptor subunit and the adapter protein Fe65 in rat brain | de |
dc.type | doctoralThesis | de |
dc.title.translated | Charakterisierung der Wechselwirkungen zwischen dem P2X<sub>2</sub> Rezeptor und dem Fe65 Adapterprotein im Rattengehirn | de |
dc.contributor.referee | Fritz, Hans-Joachim Prof. Dr. | de |
dc.date.examination | 2006-05-03 | de |
dc.subject.dnb | 500 Naturwissenschaften allgemein | de |
dc.description.abstracteng | Synaptic transmission in the nervous system is
achieved through the release of neurotransmitters from
presynaptic terminals, resulting in the activation of
neurotransmitter receptors at postsynaptic membrane.
ATP is a neurotransmitter that mediates fast synaptic
transmission in the central and peripheral nervous
system, by activating a family of ATP-gated ionotropic
receptors called P2X receptors. Mammalian P2X receptors
are formed by seven subunits
(P2X1 P2X7) of which mainly
P2X2, P2X4 and P2X6
subunits are expressed in the brain. By using
postembedding immunogold labeling combined with
electron microscopy, the three subunits have been
localized at the peripheral portion of the excitatory
postsynaptic membrane. This precise localization of P2X
subunits at excitatory synapses suggests an interaction
with intracellular regulatory or anchoring proteins, as
described for other synaptic receptors. However,
interaction partners of P2X receptor subunits in the
synapse have not been identified so far.In the present work, that question was answered by
performing a yeast two-hybrid (Y2H) screening of a rat
brain cDNA library employing the C-terminal domain of
the P2X2 subunit as a bait. This approach
allowed us to isolate the protein Fe65 as the main
interacting partner of neuronal P2X2
receptor subunits. Characteristics of the interaction
were confirmed in vitro by complementary Y2H assays and
GST-pulldown experiments. Other members of the P2X
family, as P2X4 and P2X7 were not
able to interact with Fe65, revealing the specificity
of the interaction. An interaction was found for
P2X2 and the Fe65-related protein
Fe65-like1, but was not observed between Fe65 and the
naturally occurring P2X2 splice variant
P2X2(b), indicating that alternative
splicing may regulate complex assembly. Deletions and
point mutations on both interacting partners helped to
identify that the interaction is driven by the WW
domain of Fe65 which specifically recognizes the
proline rich sequence PPPP at the C-terminus of the
P2X2 receptor.Two antibodies against Fe65 were generated,
characterized and employed to assay the subcellular
localization of this protein by immunogold-labeling
electron microscopy. Labeling for Fe65 was found at the
pre- and postsynaptic specialization of CA1 hippocampal
pyramidal cell/Schaffer collateral synapses. By double
immunogold labeling, the co-localization of Fe65 with
P2X2 subunits at the postsynaptic
specialization of excitatory synapses was observed,
suggesting that the interaction occurs in vivo. As
expected by the overlapping distribution of
P2X2 and Fe65, both proteins could be
co-immunoprecipitated from brain membrane extracts.
This experiment demonstrates that both proteins are
present in the same molecular complex providing more
evidence on the occurrence in vivo of such association.
The assembly with Fe65 was found to regulate certain
functional properties of P2X2 receptors as
demonstrated by electrophysiology recordings on HEK
cells and Xenopus laevis
oocyte heterologously expressing both proteins. While
Fe65-bound P2X2 receptors showed comparable
basic pharmacological properties, as current
amplitudes, kinetics and ATP EC50 values, permeability
changes were affected. Thus, the time- and
activation-dependent change in ionic selectivity of
P2X2 receptors was inhibited by coexpression
with Fe65. We propose that Fe65 tethers the C-terminus
of the receptor and impairs its ability permeate bulky
organic cations, suggesting a novel mechanism for
intracellular proteins in regulating receptor function
and thus ATP-mediated synaptic transmission. | de |
dc.contributor.coReferee | Jäckle, Herbert Prof. Dr. | de |
dc.subject.topic | Mathematics and Computer Science | de |
dc.subject.ger | Adapterprotein | de |
dc.subject.ger | ionotrope Rezeptoren | de |
dc.subject.ger | P2X | de |
dc.subject.ger | Fe65 | de |
dc.subject.ger | Neurotransmitter | de |
dc.subject.ger | ATP | de |
dc.subject.ger | WW Domäne | de |
dc.subject.eng | Adapter proteins | de |
dc.subject.eng | Ionotropic receptors | de |
dc.subject.eng | P2X | de |
dc.subject.eng | Fe65 | de |
dc.subject.eng | neurotransmitter | de |
dc.subject.eng | ATP | de |
dc.subject.eng | amyloid precursor protein (APP) | de |
dc.subject.eng | WW domain | de |
dc.subject.bk | 42.13 | de |
dc.identifier.urn | urn:nbn:de:gbv:7-webdoc-756-4 | de |
dc.identifier.purl | webdoc-756 | de |
dc.affiliation.institute | Medizinische Fakultät | de |
dc.subject.gokfull | WA 000: Biologie | de |
dc.subject.gokfull | WF 200: Molekularbiologie | de |
dc.identifier.ppn | 515115339 | de |