Stimulus-secretion coupling in pancreatic β-cells of healthy and diabetic rats in tissue slice preparation
Stimulus Sekretions Kopplung pankreatischer β-Zellen gesunder und diabetischer Ratten in Gewebeschnitt Präparation
by Tobias Rose
Date of Examination:2006-01-18
Date of issue:2006-07-04
Advisor:Prof. Dr. Erwin Neher
Referee:Prof. Dr. Michael Hörner
Files in this item
Name:rose.pdf
Size:8.32Mb
Format:PDF
Description:Dissertation
Abstract
English
A primary event in the development of type 2 diabetes is a decrease in the capacity of pancreatic β-cells to secrete insulin in response to glucose stimulation. The Goto Kakizaki (GK) rat is a widely used animal model to study this defective glucose-stimulated insulin release. Similar as recently shown for pancreatic islets of type 2 diabetic patients, the expression of several proteins involved in Ca2+-dependent exocytosis of insulin-containing large dense-core vesicles (LDCVs) is dysregulated in this animal model. Unexpectedly, previous studies failed to demonstrate a defect in late, Ca2+-dependent steps of insulin secretion. These studies, however, either lacked the temporal and spatial resolution to reveal subtle kinetic alterations of LDCV release, or were performed in vitro on isolated β-cells in primary cell culture, an invasive preparation that is known to alter the secretory function of β-cells.To resolve the apparent contradiction between biochemical data and the physiological studies performed so far we established a novel tissue slice preparation of rat pancreas. With its higher degree of preservation of cellular interaction this preparation resembles more closely the in vivo situation of pancreatic physiology. We studied the coupling of stimulus-induced Ca2+ influx and insulin secretion of healthy and diabetic rat β-cells by assessing exocytosis with high time-resolution measurements of membrane capacitance and whole-cell currents.β-cells in fresh pancreatic tissue slices of GK rats responded to glucose stimulation with a normal oscillatory increase in the cytosolic Ca2+ concentration. However, secretion from GK rat β-cells was defective in spite of putatively compensatory mechanisms like prominently upregulated cell size and increased voltage-activated Ca2+ currents. This impairment presented itself as a depressed initial release rate in response to trains of depolarizing pulses and a reduction in the efficacy of Ca2+ to trigger secretion. This was neither due to a decrease of functional vesicle pool sizes nor due to different kinetics of pool refilling. Unexpectedly, strong stimulation with two successive trains of depolarizing pulses led to a prominent facilitation of release in GK rat β-cells whereas secretion in controls was unaffected. The latter finding is in line with the paradoxical hypersecretion due to strongly depolarizing non-nutrient stimulation found in GK rats as well as individuals suffering from type 2 diabetes. Using a pharmacological approach to inhibit protein kinase activity in healthy and diabetic rat β-cells, our data furthermore indicates that the underlying cause for the observed phenomena in β-cells of diabetic GK rats might be chronically enhanced protein kinase C (PKC) activity. Broad-range inhibition of PKC increased the apparent Ca2+ sensitivity of exocytosis whereas it prevented the activity-dependent facilitation in GK rat β-cells.We conclude that a decrease in the apparent Ca2+ sensitivity of the GK rat β-cell release machinery is involved in defective glucose-stimulated insulin secretion of this animal model. Furthermore, we propose a role for constitutively increased activity of one ore more PKC isoenzymes in the diabetic phenotype of GK rat β-cells.
Keywords: exocytosis; secretion; insulin; PKC; slice preparation; capacitance measurements; beta cell; pancreas; type 2 diabetes; electrophysiology
Other Languages
Eines der ersten Ereignisse in der Entwicklung von
Diabetes des Typs 2 ist eine verringerte Kapazität der
β-Zellen des Pankreas, Insulin als Antwort auf eine
Stimulation mit Glukose zu sezernieren. Die Goto
Kakizaki (GK) Ratte ist ein häufig genutztes Tiermodel,
um diese defekte Insulinfreisetzung zu studieren.
Ähnlich, wie kürzlich für Patienten mit Diabetes des
Typs 2 gezeigt wurde, kommt es in diesem Tiermodell zu
einer fehlregulierten Expression mehrerer der Proteine,
die an der Ca2+-abhängigen Exozytose Insulin
enthaltender Large Dense Core Vesikel (LDCV)
beteiligt sind. Vorhergehende Studien konnten jedoch
bisher keinen Defekt der Ca2+-abhängigen
Schritte der Insulinsekretion aufzeigen. Diesen Studien
fehlte jedoch entweder die zeitliche und räumliche
Auflösung, um subtile Veränderungen der LDCV
Freisetzung beobachten zu können, oder sie wurden
in vitro anhand isolierter
β-Zellen in primärer Zellkultur durchgeführt, einer
Präparation, die bekannt ist dafür, dass sie die
Sekretionsfunktion von β-Zellen negativ
beeinträchtigt.Um den offensichtlichen Widerspruch zwischen den
biochemischen Daten und den bisher durchgeführten
physiologische Studien aufzulösen, haben wir mit der
Gewebeschnitt Präparation des Pankreas der Ratte eine
Methode etabliert, die dank der Bewahrung der komplexen
zellulären Organisation mehr als bisherige
Präparationen der in vivo
Physiologie entspricht. Wir untersuchten den
Zusammenhang von Stimulus evoziertem Ca2+
Einstrom und Insulin Sekretion in β-Zellen gesunder und
diabetischer Ratten, indem wir den Vorgang der
Exozytose mittels zeitlich hoch aufgelösten Messungen
von Membrankapazität und Ganzzell Ionenströmen
beobachteten.β-Zellen in frischen Gewebeschnitten des Pankreas
antworteten auf eine Stimulation mit Glukose mit einem
normalen, oszillierenden Anstieg der zytosolischen
Ca2+ Konzentration. Ungeachtet dessen war
die Sekretion von β-Zellen der GK Ratten gestört. Trotz
vermutlich kompensatorischer Mechanismen, wie einer
ausgeprägten Vergrößerung der Zellen und einer Erhöhung
des spannungsabhängigen Ca2+ Einstroms,
zeigten diabetische β-Zellen eine anfänglich geringere
Freisetzungsgeschwindigkeit und verringerte
Effektivität von Ca2+, Sekretion
hervorzurufen wenn die Zellen mit hoch-frequenten
depolarisierenden Stimuli gereizt wurden.
Unerwarteterweise führte die intensive Erregung der
Zellen mit zwei aufeinander folgenden Einheiten
hoch-frequenter Stimulation zu einer ausgeprägten
Erhöhung der Sekretion in diabetischen β-Zellen
( Bahnung ), wohingegen die gleiche Stimulation keine
Veränderung in gesunden β-Zellen hervorrief. Letzteres
steht in Übereinstimmung mit der häufig beobachteten
paradoxen Hypersekretion, die sowohl in GK Ratten als
auch Patienten mit Diabetes des Typs 2 durch stark
depolarisierende Stimuli hervorgerufen wird. Mittels
einer pharmakologischen Unterdrückung der Aktivität von
Protein Kinasen konnten wir ferner zeigen, dass eine
wahrscheinliche Erklärung für die von uns beobachteten
Phänomene eine chronisch Erhöhte Aktivität der Protein
Kinase C (PKC) ist. Eine Breitband Inhibierung von PKC
Isoformen erhöhte sowohl die apparente Ca2+
Sensitivität der Exozytose und verhinderte die
aktivitäts-abhängige Bahnung in β-Zellen diabetischer
GK Ratten.Wir kommen zu dem Ergebnis, dass eine Erniedrigung
der apparenten Ca2+ Sensitivität des
sekretorischen Apparates der β-Zellen von GK Ratten an
der defekten Insulin Sekretion bei Glukosestimulation
beteiligt ist. Ferner schlagen wir vor, dass eine
chronisch erhöhte Aktivität einer oder mehrerer PKC
Isoformen am diabetischen Phänotyp von GK Ratten
beteiligt ist.
Schlagwörter: Exozytose; Sekretion; Insulin; PKC; Kapazitäts Messungen; Beta Zelle; Pankreas; Typ 2 Diabetes; Elektrophysiologie