Konsequenzen der Expression des Ether à go-go Kaliumkanals
Consequences of the ether à go-go potassium channel expression
by Claudia Weber
Date of Examination:2006-07-06
Date of issue:2006-08-02
Advisor:Prof. Dr. Rüdiger Hardeland
Referee:Prof. Dr. Andreas Stumpner
Files in this item
Name:weber.pdf
Size:3.35Mb
Format:PDF
Description:Dissertation
Abstract
English
This work provides the first description of a highly effective and specific siRNA-based inhibitor for the potential oncogene hEAG1 (human ether à go-go channel), which proved to be effective on RNA, protein and activity as well as functional level (proliferation, modulation of expression of target genes). Therefore this study created a basis for the development of an EAG1-specific cancer therapy. The zinc finger transcription factor MAZ was identified as a downstream target of EAG1 by means of two independent methods, the subtractive hybridization and RNA interference. A definite time course of MAZ induction was observed in three model cell lines when EAG1 expression was shut down by RNAi. Binding sites for this transcription factor have been detected in promoters of cancer related genes like c-MYC (Kabilova et al., 2006) and TERT (Cong et al., 2002) regulating their expression. This prompted the investigation of the time courses of these two genes upon EAG1-siRNA treatment resulting in a significant repression of the amount of their RNA. Moreover, by applying new controls and an optimization strategy this work represents a significant contribution to the research field of RNAi. Several genes responsible for the physiological function of EAG1 were detected by subtractive hybridization and verified by quantitative Real-Time-PCR (RACK1, MMP2, Fibronektin, GAPDH). First evidence for the existance of multiple forms of EAG1 in cancer cell lines differing from the form present in brain were found by sequencing.Additionally, EAG RNA has been localized in several organs outside of the brain in mice and has been shown to be modulated in peripheral organs, but not in brain, by triggering a sterile inflammation by intraperitoneal injection of Lipopolysaccharides (LPS).
Keywords: oncogene; cancer; potassium channel; EAG; MAZ; c-MYC; hTERT; specific inhibitor; RNAi; proliferation; cDNA array; subtractive hybridization; differential expression; LPS; mutation
Other Languages
In dieser Arbeit wurde mit der
RNA-Interferenz-Methode zum ersten Mal eine effektive
und hochspezifische Möglichkeit gefunden, den
potentiell onkogenen hEAG1-Kanal (menschlicher Ether à
go-go-Kanal) sowohl auf RNA-, Protein- und
Aktivitätsebene als auch auf Funktionsebene
(Proliferation, Expressionsmodulation von Zielgenen) zu
hemmen und somit eine Grundlage für die Entwicklung
einer EAG1-spezifischen Krebstherapie geschaffen. Es
gelang in der vorliegenden Arbeit mit zwei unabhängigen
Methoden, der Inhibierung von EAG mit siRNAs und der
subtraktiven Hybridisierung, den
Zinkfinger-Transkriptionsfaktor MAZ als flussabwärts
liegendes Zielgen von hEAG1 zu identifizieren. In den
drei Modellzelllinien konnte ein defininierter
Induktionszeitverlauf von MAZ durch Stilllegung von
EAG1 beobachtet werden. Bindungsstellen für diesen
Transkriptionsfaktor kommen in den Promotoren mehrerer
mit Krebs in Verbindung gebrachter Gene wie dem c-MYC-
(Kabilova et al., 2006) und TERT-Gen (Cong et al.,
2002) vor und regulieren dort die Genexpression. Daher
wurden auch Zeitverläufe von diesen beiden
MAZ-Zielgenen nach Stilllegung von EAG mit RNAi
aufgenommen und eine signifikante Repression der
RNA-Menge in den siRNA-behandelten Zellen beobachtet.
Es konnte außerdem durch die Optimierungsstrategie und
das Design von neuen Kontrollen ein signifikanter
allgemeiner Beitrag zum neuen Forschungsfeld der
RNA-Interferenz geleistet werden. Weitere Gene, die für
die physiologische Funktion der EAG1-Expression in
menschlichen Zelllinien und Krebszelllinien
verantwortlich sein könnten, konnten mit der
subtraktiven Hybridisierung gefunden und mit
quantitativer Real-Time-PCR verifiziert werden (RACK1,
MMP2, Fibronektin, GAPDH). Es wurden durch die
Sequenzierung von hEAG1 aus Krebszelllinien erste
Hinweise darauf gefunden, dass EAG1 in
unterschiedlichen Formen in Krebszellen vorkommt, deren
Sequenzen von der hEAG1-Sequenz im Gehirn
abweichen.In dieser Arbeit wurde erstmals das Vorkommen von
EAG-Kanälen außerhalb des Gehirns in mehreren Organen
der Maus beschrieben. In weiterführenden Experimenten
konnte erstmals die EAG-mRNA-Expression in Mäusen durch
die Auslösung einer sterilen Entzündung durch
intraperitoneale Injektion von Lipopolysacchariden
außerhalb des Gehirns induziert oder reprimiert werden,
während sie im Gehirn unverändert blieb.
Schlagwörter: Onkogen; Krebs; Kaliumkanal; EAG; MAZ; c-MYC; hTERT; spezifischer Inhibitor; RNAi; Proliferation; cDNA-Array; subtraktive Hybridisierung; differentielle Expression; LPS; Mutation