Konsequenzen der Expression des Ether à go-go Kaliumkanals

Abstract

In dieser Arbeit wurde mit der RNA-Interferenz-Methode zum ersten Mal eine effektive und hochspezifische Möglichkeit gefunden, den potentiell onkogenen hEAG1-Kanal (menschlicher Ether à go-go-Kanal) sowohl auf RNA-, Protein- und Aktivitätsebene als auch auf Funktionsebene (Proliferation, Expressionsmodulation von Zielgenen) zu hemmen und somit eine Grundlage für die Entwicklung einer EAG1-spezifischen Krebstherapie geschaffen. Es gelang in der vorliegenden Arbeit mit zwei unabhängigen Methoden, der Inhibierung von EAG mit siRNAs und der subtraktiven Hybridisierung, den Zinkfinger-Transkriptionsfaktor MAZ als flussabwärts liegendes Zielgen von hEAG1 zu identifizieren. In den drei Modellzelllinien konnte ein defininierter Induktionszeitverlauf von MAZ durch Stilllegung von EAG1 beobachtet werden. Bindungsstellen für diesen Transkriptionsfaktor kommen in den Promotoren mehrerer mit Krebs in Verbindung gebrachter Gene wie dem c-MYC- (Kabilova et al., 2006) und TERT-Gen (Cong et al., 2002) vor und regulieren dort die Genexpression. Daher wurden auch Zeitverläufe von diesen beiden MAZ-Zielgenen nach Stilllegung von EAG mit RNAi aufgenommen und eine signifikante Repression der RNA-Menge in den siRNA-behandelten Zellen beobachtet. Es konnte außerdem durch die Optimierungsstrategie und das Design von neuen Kontrollen ein signifikanter allgemeiner Beitrag zum neuen Forschungsfeld der RNA-Interferenz geleistet werden. Weitere Gene, die für die physiologische Funktion der EAG1-Expression in menschlichen Zelllinien und Krebszelllinien verantwortlich sein könnten, konnten mit der subtraktiven Hybridisierung gefunden und mit quantitativer Real-Time-PCR verifiziert werden (RACK1, MMP2, Fibronektin, GAPDH). Es wurden durch die Sequenzierung von hEAG1 aus Krebszelllinien erste Hinweise darauf gefunden, dass EAG1 in unterschiedlichen Formen in Krebszellen vorkommt, deren Sequenzen von der hEAG1-Sequenz im Gehirn abweichen.In dieser Arbeit wurde erstmals das Vorkommen von EAG-Kanälen außerhalb des Gehirns in mehreren Organen der Maus beschrieben. In weiterführenden Experimenten konnte erstmals die EAG-mRNA-Expression in Mäusen durch die Auslösung einer sterilen Entzündung durch intraperitoneale Injektion von Lipopolysacchariden außerhalb des Gehirns induziert oder reprimiert werden, während sie im Gehirn unverändert blieb.