Structural/functional analysis of synaptotagmin 1 in synaptic transmission using hippocampal autapses

Abstract

Synaptotagmin 1 ist ein präsynaptisches, vesikuläres Protein, das als mutmaßlicher Ca2+-Sensor für schnelle Freisetzung von Neurotransmitter im Zentralnervensystem genannt wird. Die Proteinstruktur weist zwei Ca2+-bindende C2-Domänen am zytosolischen C-Terminus auf. Die Wechselwirkung von Synaptotagmin 1 mit anderen Molekülen wurden zwar in neueren Studien schon weitgehend biochemisch untersucht, aber die physiologische Funktion der beiden C2-Domänen sowie die Rolle des Synaptotagmin 1 im Mechanismus der Exozytose sind noch immer nicht genau verstanden.Um einige der offenen Fragen genauer zu beantworten, wurde die vorliegende Studie durchgeführt, unter Kombination von elektrophysiologischen und molekularbiologischen Techniken. Mit der Patch-Clamp-Technik wurden hippocampale Neuronen, die Synaptotagmin 1 Deletions-mutiert waren, aus muraler primärer Kultur nach Transfektion mit mutiertem Synaptotagmin 1 in Standard-Ganzzellableitung elektrophysiologisch untersucht. Um genauer herauszufinden, wie die Struktur der C2-Domänen wichtig für die Funktion von Synaptotagmin 1 ist, wurden gezielt unterschiedliche Mutationen in die C2-Domänen eingebracht. Entweder wurde eine der beiden C2-Domäne trunkiert oder in dieser die jeweiligen Ca2+-Bindungsstellen durch Austausch von Aspartat neutralisiert (D172, 230, 232A; D303, 363, 365A) oder eine der C2-Domänen durch eine aus der Isoform Synaptotagmin 7 ausgetauscht. Die erhaltenen Befunde legen nahe, daß die beiden C2-Domänen, C2A und C2B, nicht redundant sind bei der Synaptische Transmission: Die C2A-Domäne steht funktional im Zusammenhang mit der Regulation der Anzahl der freisetzungskompetenten Vesikel (des readily releasable pool), während die C2B-Domäne für die schnelle Freisetzung essentiell ist.Synaptotagmin 1 enthält einige hydrophobe Aminosäurereste (M173, F231, 234; V304, Y364, I367) in den C2-Domänen, für die aus biochemischen Studien bekannt ist, daß sie mit den Phospholipiden der Plasmamembran interagieren. Wir ersetzten diese Reste jeweils durch Tryptophan, um die Hydrophobizität in den Domänen spezifisch zu erhöhen, was mit deren physiologischen Affinität zu Phospholipiden korrelieren sollte. Erwartungsgemäß bewirkten diese Mutationen eine Erhöhung der Freisetzungswahrscheinlichkeit und offenbar auch der Ca2+-Sensitivität der synaptischen Freisetzung in den untersuchten Neuronen. Desweiteren wurde gezeigt, daß die mehrfach basischen Reste in der C2B-Domäne von Synaptotagmin 1 vielfältig wechselwirken unter anderem mit einem weiteren Synaptotagmin-Molekül, mit PIP2 in der Plasmamembran, mit AP-2, mit Ca2+-Knälen. Diese Wechselwirkungen können offenbar inhibiert werden, indem man diese Reste neutralisiert (K326, 327A). Die physiologische Analyse des Phänotyps von Synaptotagmin 1 mit der K326,-327A-Mutation zeigte, daß die Neurotransmitter-Freisetzung mit dieser nicht vollständig inhibiert, sondern nur deren Stärke reduziert wird, was mit der jeweiligen Abnahme der in vitro gemessenen Ca2+-abhängigen Affinität von Synaptotagmin 1 zu Phospholipid korreliert. Interessanterweise weist dieser K326,-327A-Phänotyp eine eindrucksvolle Ähnlichkeit zu der in der Literatur beschriebenen Mutation der C2A-Domäne R233Q. Um diesen Befund weiter zu untersuchen, wurde die Region der R233Q-Mutation in der C2B-Domäne analog mutiert (K366Q). Diese verhielt sich indes ähnlich wie Wildtyp, und zwar sowohl in vitro als auch in vivo. Die ungleiche Verteilung der genannten basischen Reste zwischen den beiden C2-Domänen legt somit nahe, daß die beiden C2-Domänen in Gegenwart von Ca2+ mit der Plasmamembran mit unterschiedlicher Orientierung interagieren.Diese Studien an diesen Mutationen der C2-Domänen legen zusammen nahe, daß die Ca2+-abhängige Wechselwirkung von Synaptotagmin 1 mit Phospholipiden die Effizient der Synaptischen Transmission entscheidend beeinflußt, was schließlich auch die Hypothese stützt, daß die Wechselwirkung von Synaptotagmin 1 mit Plasmamembran für die Fusion von Vesikeln und damit für die Freisetzung deren Inhalts von essentieller Bedeutung ist.