dc.contributor.advisor | Rosenmund, Christian PD Dr. | de |
dc.contributor.author | Liyi, Li | de |
dc.date.accessioned | 2012-05-16T12:13:00Z | de |
dc.date.available | 2013-01-30T23:50:31Z | de |
dc.date.issued | 2005-06-10 | de |
dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0006-B6EB-4 | de |
dc.identifier.uri | http://dx.doi.org/10.53846/goediss-1423 | |
dc.description.abstract | Synaptotagmin 1 ist ein präsynaptisches, vesikuläres
Protein, das als mutmaßlicher Ca2+-Sensor für schnelle
Freisetzung von Neurotransmitter im Zentralnervensystem
genannt wird. Die Proteinstruktur weist zwei
Ca2+-bindende C2-Domänen am zytosolischen C-Terminus
auf. Die Wechselwirkung von Synaptotagmin 1 mit anderen
Molekülen wurden zwar in neueren Studien schon
weitgehend biochemisch untersucht, aber die
physiologische Funktion der beiden C2-Domänen sowie die
Rolle des Synaptotagmin 1 im Mechanismus der Exozytose
sind noch immer nicht genau verstanden.Um einige der offenen Fragen genauer zu beantworten,
wurde die vorliegende Studie durchgeführt, unter
Kombination von elektrophysiologischen und
molekularbiologischen Techniken. Mit der
Patch-Clamp-Technik wurden hippocampale Neuronen, die
Synaptotagmin 1 Deletions-mutiert waren, aus muraler
primärer Kultur nach Transfektion mit mutiertem
Synaptotagmin 1 in Standard-Ganzzellableitung
elektrophysiologisch untersucht. Um genauer
herauszufinden, wie die Struktur der C2-Domänen wichtig
für die Funktion von Synaptotagmin 1 ist, wurden
gezielt unterschiedliche Mutationen in die C2-Domänen
eingebracht. Entweder wurde eine der beiden C2-Domäne
trunkiert oder in dieser die jeweiligen
Ca2+-Bindungsstellen durch Austausch von Aspartat
neutralisiert (D172, 230, 232A; D303, 363, 365A) oder
eine der C2-Domänen durch eine aus der Isoform
Synaptotagmin 7 ausgetauscht. Die erhaltenen Befunde
legen nahe, daß die beiden C2-Domänen, C2A und C2B,
nicht redundant sind bei der Synaptische Transmission:
Die C2A-Domäne steht funktional im Zusammenhang mit der
Regulation der Anzahl der freisetzungskompetenten
Vesikel (des readily releasable pool), während die
C2B-Domäne für die schnelle Freisetzung essentiell
ist.Synaptotagmin 1 enthält einige hydrophobe
Aminosäurereste (M173, F231, 234; V304, Y364, I367) in
den C2-Domänen, für die aus biochemischen Studien
bekannt ist, daß sie mit den Phospholipiden der
Plasmamembran interagieren. Wir ersetzten diese Reste
jeweils durch Tryptophan, um die Hydrophobizität in den
Domänen spezifisch zu erhöhen, was mit deren
physiologischen Affinität zu Phospholipiden korrelieren
sollte. Erwartungsgemäß bewirkten diese Mutationen eine
Erhöhung der Freisetzungswahrscheinlichkeit und
offenbar auch der Ca2+-Sensitivität der synaptischen
Freisetzung in den untersuchten Neuronen. Desweiteren
wurde gezeigt, daß die mehrfach basischen Reste in der
C2B-Domäne von Synaptotagmin 1 vielfältig wechselwirken
unter anderem mit einem weiteren
Synaptotagmin-Molekül, mit PIP2 in der Plasmamembran,
mit AP-2, mit Ca2+-Knälen. Diese Wechselwirkungen
können offenbar inhibiert werden, indem man diese Reste
neutralisiert (K326, 327A). Die physiologische Analyse
des Phänotyps von Synaptotagmin 1 mit der
K326,-327A-Mutation zeigte, daß die
Neurotransmitter-Freisetzung mit dieser nicht
vollständig inhibiert, sondern nur deren Stärke
reduziert wird, was mit der jeweiligen Abnahme der in
vitro gemessenen Ca2+-abhängigen Affinität von
Synaptotagmin 1 zu Phospholipid korreliert.
Interessanterweise weist dieser K326,-327A-Phänotyp
eine eindrucksvolle Ähnlichkeit zu der in der Literatur
beschriebenen Mutation der C2A-Domäne R233Q. Um diesen
Befund weiter zu untersuchen, wurde die Region der
R233Q-Mutation in der C2B-Domäne analog mutiert
(K366Q). Diese verhielt sich indes ähnlich wie Wildtyp,
und zwar sowohl in vitro als auch in vivo. Die
ungleiche Verteilung der genannten basischen Reste
zwischen den beiden C2-Domänen legt somit nahe, daß die
beiden C2-Domänen in Gegenwart von Ca2+ mit der
Plasmamembran mit unterschiedlicher Orientierung
interagieren.Diese Studien an diesen Mutationen der C2-Domänen
legen zusammen nahe, daß die Ca2+-abhängige
Wechselwirkung von Synaptotagmin 1 mit Phospholipiden
die Effizient der Synaptischen Transmission
entscheidend beeinflußt, was schließlich auch die
Hypothese stützt, daß die Wechselwirkung von
Synaptotagmin 1 mit Plasmamembran für die Fusion von
Vesikeln und damit für die Freisetzung deren Inhalts
von essentieller Bedeutung ist. | de |
dc.format.mimetype | application/pdf | de |
dc.language.iso | eng | de |
dc.rights.uri | http://webdoc.sub.gwdg.de/diss/copyr_diss.html | de |
dc.title | Structural/functional analysis of synaptotagmin 1 in synaptic transmission using hippocampal autapses | de |
dc.type | doctoralThesis | de |
dc.title.translated | Struktuelle und funktionelle Analyse von Synaptotagmin 1 in synaptischer Transmission in hippocampalen Autapsen | de |
dc.contributor.referee | Jahn, Reinhard Prof. Dr. | de |
dc.date.examination | 2005-05-24 | de |
dc.subject.dnb | 500 Naturwissenschaften allgemein | de |
dc.description.abstracteng | Synaptotagmin 1 is a presynaptic vesicular protein,
which has been implicated as a putative Ca2+ sensor for
fast neurotransmitter release in central nervous
system. Structurally, it possesses two Ca2+ binding C2
domains in its cytosolic C-terminal. The biochemical
interaction of synaptotagmin 1 with other molecules has
been extensively addressed in recent studies, while the
exact physiological roles of the two C2 domains and the
mechanism of action of synaptotagmin 1 in exocytosis
are still poorly understood.To answer these questions better, a systematic study
combining electrophysiological and molecular biological
approaches was performed. The synaptic transmission of
the cultured synaptotagmin 1 null murine hippocampal
neurons transfected with the mutated synaptotagmin 1
was evaluated with standard whole-cell patch clamp
electrophysiology. To take a closer look at how the
structure of the C2 domains is important for the
function of synaptotagmin 1, we made a series of the C2
domain mutations. Truncation of either C2 domain,
neutralization of the Ca2+ binding aspartate sites
(namely, D172, 230, 232A; D303, 363, 365A) in either C2
domain and replacement of either C2 domains with the C2
domain from other synaptotagmin isoform (i.e.
synaptotagmin 7) all suggested that the two C2 domains
are non redundant in synaptic transmission.
Specifically, the C2A domain is related to readily
releasable pool control and the regulation of fast
release, whereas the C2B domain is essential for fast
release.Synaptotagmin 1 has a set of hydrophobic residues
(M173, F231, 234; V304, Y364, I367) in the C2 domains,
which have been biochemically shown to interact with
the phospholipid plasma membrane. We replaced these
residues with Tryptophans with the idea of introducing
greater hydrophobicity into the domains so as to
correlate its physiological consequences on its
phospholipid binding. These mutations result in
enhancement in the release probability and apparent
Ca2+ sensitivity. Furthermore, the polybasic residues
in the C2B domain of synaptotagmin 1 have been shown to
have multiple interactions (i. e. with another copy of
synaptotagmin, PIP2 in plasma membrane, AP-2 and Ca2+
channels, etc). These interactions can be abolished by
neutralizing these residues (K326, 327A). The
physiological analysis of the phenotype of
synaptotagmin 1 with K326, 327A mutation shows that the
neurotransmitter release does not get abolished, rather
it is reduced, which correlates with a corresponding
decrease in in vitro Ca2+ dependent synaptotagmin
1-phospholipid binding. Interestingly, this K326, 327A
phenotype bears striking similarity to the previously
described synaptotagmin 1 C2A domain R233Q mutation. To
further investigate this phenomenon, the corresponding
site of the R233Q mutation in the C2B domain was
mutated (K366Q), however, the latter one showed a wild
type like behavior both in vitro and in vivo. Taken
together, the asymmetrical distribution of these basic
residues for vesicle release control in the two C2
domains indicates that the two C2 domains interact with
plasma membrane upon coming Ca2+ in different
orientation.Overall, these C2 domain mutation studies suggest
that the Ca2+ dependent synaptotagmin 1-phospholipid
interaction is critical for the efficiency of synaptic
transmission, which ultimately supports the general
notion that synaptotagmin 1 must essentially interact
with the plasma membrane so as to enable vesicle
fusion. | de |
dc.contributor.coReferee | Knepel, Willhart Prof. Dr. | de |
dc.contributor.thirdReferee | Neher, Erwin Prof. Dr. | de |
dc.subject.topic | Mathematics and Computer Science | de |
dc.subject.ger | synaptotagmin | de |
dc.subject.ger | des readily releasable pool | de |
dc.subject.ger | Freisetzungswahrscheinlichkeit | de |
dc.subject.ger | der Ca2+-Sensitivität | de |
dc.subject.ger | Wechselwirkung von Synaptotagmin 1 mit Phospholipiden | de |
dc.subject.eng | synaptotagmin | de |
dc.subject.eng | readily releasable pool | de |
dc.subject.eng | release probability | de |
dc.subject.eng | Ca2+ sensitivity | de |
dc.subject.eng | synaptotagmin 1-phospholipid interaction | de |
dc.subject.bk | 42.13 | de |
dc.identifier.urn | urn:nbn:de:gbv:7-webdoc-91-7 | de |
dc.identifier.purl | webdoc-91 | de |
dc.affiliation.institute | Biologische Fakultät inkl. Psychologie | de |
dc.subject.gokfull | W | de |
dc.identifier.ppn | 502072601 | de |