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dc.contributor.advisor Rosenmund, Christian PD Dr. de
dc.contributor.author Liyi, Li de
dc.date.accessioned 2012-05-16T12:13:00Z de
dc.date.available 2013-01-30T23:50:31Z de
dc.date.issued 2005-06-10 de
dc.identifier.uri http://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0006-B6EB-4 de
dc.description.abstract Synaptotagmin 1 ist ein präsynaptisches, vesikuläres Protein, das als mutmaßlicher Ca2+-Sensor für schnelle Freisetzung von Neurotransmitter im Zentralnervensystem genannt wird. Die Proteinstruktur weist zwei Ca2+-bindende C2-Domänen am zytosolischen C-Terminus auf. Die Wechselwirkung von Synaptotagmin 1 mit anderen Molekülen wurden zwar in neueren Studien schon weitgehend biochemisch untersucht, aber die physiologische Funktion der beiden C2-Domänen sowie die Rolle des Synaptotagmin 1 im Mechanismus der Exozytose sind noch immer nicht genau verstanden.Um einige der offenen Fragen genauer zu beantworten, wurde die vorliegende Studie durchgeführt, unter Kombination von elektrophysiologischen und molekularbiologischen Techniken. Mit der Patch-Clamp-Technik wurden hippocampale Neuronen, die Synaptotagmin 1 Deletions-mutiert waren, aus muraler primärer Kultur nach Transfektion mit mutiertem Synaptotagmin 1 in Standard-Ganzzellableitung elektrophysiologisch untersucht. Um genauer herauszufinden, wie die Struktur der C2-Domänen wichtig für die Funktion von Synaptotagmin 1 ist, wurden gezielt unterschiedliche Mutationen in die C2-Domänen eingebracht. Entweder wurde eine der beiden C2-Domäne trunkiert oder in dieser die jeweiligen Ca2+-Bindungsstellen durch Austausch von Aspartat neutralisiert (D172, 230, 232A; D303, 363, 365A) oder eine der C2-Domänen durch eine aus der Isoform Synaptotagmin 7 ausgetauscht. Die erhaltenen Befunde legen nahe, daß die beiden C2-Domänen, C2A und C2B, nicht redundant sind bei der Synaptische Transmission: Die C2A-Domäne steht funktional im Zusammenhang mit der Regulation der Anzahl der freisetzungskompetenten Vesikel (des readily releasable pool), während die C2B-Domäne für die schnelle Freisetzung essentiell ist.Synaptotagmin 1 enthält einige hydrophobe Aminosäurereste (M173, F231, 234; V304, Y364, I367) in den C2-Domänen, für die aus biochemischen Studien bekannt ist, daß sie mit den Phospholipiden der Plasmamembran interagieren. Wir ersetzten diese Reste jeweils durch Tryptophan, um die Hydrophobizität in den Domänen spezifisch zu erhöhen, was mit deren physiologischen Affinität zu Phospholipiden korrelieren sollte. Erwartungsgemäß bewirkten diese Mutationen eine Erhöhung der Freisetzungswahrscheinlichkeit und offenbar auch der Ca2+-Sensitivität der synaptischen Freisetzung in den untersuchten Neuronen. Desweiteren wurde gezeigt, daß die mehrfach basischen Reste in der C2B-Domäne von Synaptotagmin 1 vielfältig wechselwirken unter anderem mit einem weiteren Synaptotagmin-Molekül, mit PIP2 in der Plasmamembran, mit AP-2, mit Ca2+-Knälen. Diese Wechselwirkungen können offenbar inhibiert werden, indem man diese Reste neutralisiert (K326, 327A). Die physiologische Analyse des Phänotyps von Synaptotagmin 1 mit der K326,-327A-Mutation zeigte, daß die Neurotransmitter-Freisetzung mit dieser nicht vollständig inhibiert, sondern nur deren Stärke reduziert wird, was mit der jeweiligen Abnahme der in vitro gemessenen Ca2+-abhängigen Affinität von Synaptotagmin 1 zu Phospholipid korreliert. Interessanterweise weist dieser K326,-327A-Phänotyp eine eindrucksvolle Ähnlichkeit zu der in der Literatur beschriebenen Mutation der C2A-Domäne R233Q. Um diesen Befund weiter zu untersuchen, wurde die Region der R233Q-Mutation in der C2B-Domäne analog mutiert (K366Q). Diese verhielt sich indes ähnlich wie Wildtyp, und zwar sowohl in vitro als auch in vivo. Die ungleiche Verteilung der genannten basischen Reste zwischen den beiden C2-Domänen legt somit nahe, daß die beiden C2-Domänen in Gegenwart von Ca2+ mit der Plasmamembran mit unterschiedlicher Orientierung interagieren.Diese Studien an diesen Mutationen der C2-Domänen legen zusammen nahe, daß die Ca2+-abhängige Wechselwirkung von Synaptotagmin 1 mit Phospholipiden die Effizient der Synaptischen Transmission entscheidend beeinflußt, was schließlich auch die Hypothese stützt, daß die Wechselwirkung von Synaptotagmin 1 mit Plasmamembran für die Fusion von Vesikeln und damit für die Freisetzung deren Inhalts von essentieller Bedeutung ist. de
dc.format.mimetype application/pdf de
dc.language.iso eng de
dc.rights.uri http://webdoc.sub.gwdg.de/diss/copyr_diss.html de
dc.title Structural/functional analysis of synaptotagmin 1 in synaptic transmission using hippocampal autapses de
dc.type doctoralThesis de
dc.title.translated Struktuelle und funktionelle Analyse von Synaptotagmin 1 in synaptischer Transmission in hippocampalen Autapsen de
dc.contributor.referee Jahn, Reinhard Prof. Dr. de
dc.date.examination 2005-05-24 de
dc.subject.dnb 500 Naturwissenschaften allgemein de
dc.description.abstracteng Synaptotagmin 1 is a presynaptic vesicular protein, which has been implicated as a putative Ca2+ sensor for fast neurotransmitter release in central nervous system. Structurally, it possesses two Ca2+ binding C2 domains in its cytosolic C-terminal. The biochemical interaction of synaptotagmin 1 with other molecules has been extensively addressed in recent studies, while the exact physiological roles of the two C2 domains and the mechanism of action of synaptotagmin 1 in exocytosis are still poorly understood.To answer these questions better, a systematic study combining electrophysiological and molecular biological approaches was performed. The synaptic transmission of the cultured synaptotagmin 1 null murine hippocampal neurons transfected with the mutated synaptotagmin 1 was evaluated with standard whole-cell patch clamp electrophysiology. To take a closer look at how the structure of the C2 domains is important for the function of synaptotagmin 1, we made a series of the C2 domain mutations. Truncation of either C2 domain, neutralization of the Ca2+ binding aspartate sites (namely, D172, 230, 232A; D303, 363, 365A) in either C2 domain and replacement of either C2 domains with the C2 domain from other synaptotagmin isoform (i.e. synaptotagmin 7) all suggested that the two C2 domains are non redundant in synaptic transmission. Specifically, the C2A domain is related to readily releasable pool control and the regulation of fast release, whereas the C2B domain is essential for fast release.Synaptotagmin 1 has a set of hydrophobic residues (M173, F231, 234; V304, Y364, I367) in the C2 domains, which have been biochemically shown to interact with the phospholipid plasma membrane. We replaced these residues with Tryptophans with the idea of introducing greater hydrophobicity into the domains so as to correlate its physiological consequences on its phospholipid binding. These mutations result in enhancement in the release probability and apparent Ca2+ sensitivity. Furthermore, the polybasic residues in the C2B domain of synaptotagmin 1 have been shown to have multiple interactions (i. e. with another copy of synaptotagmin, PIP2 in plasma membrane, AP-2 and Ca2+ channels, etc). These interactions can be abolished by neutralizing these residues (K326, 327A). The physiological analysis of the phenotype of synaptotagmin 1 with K326, 327A mutation shows that the neurotransmitter release does not get abolished, rather it is reduced, which correlates with a corresponding decrease in in vitro Ca2+ dependent synaptotagmin 1-phospholipid binding. Interestingly, this K326, 327A phenotype bears striking similarity to the previously described synaptotagmin 1 C2A domain R233Q mutation. To further investigate this phenomenon, the corresponding site of the R233Q mutation in the C2B domain was mutated (K366Q), however, the latter one showed a wild type like behavior both in vitro and in vivo. Taken together, the asymmetrical distribution of these basic residues for vesicle release control in the two C2 domains indicates that the two C2 domains interact with plasma membrane upon coming Ca2+ in different orientation.Overall, these C2 domain mutation studies suggest that the Ca2+ dependent synaptotagmin 1-phospholipid interaction is critical for the efficiency of synaptic transmission, which ultimately supports the general notion that synaptotagmin 1 must essentially interact with the plasma membrane so as to enable vesicle fusion. de
dc.contributor.coReferee Knepel, Willhart Prof. Dr. de
dc.contributor.thirdReferee Neher, Erwin Prof. Dr. de
dc.subject.topic Mathematics and Computer Science de
dc.subject.ger synaptotagmin de
dc.subject.ger des readily releasable pool de
dc.subject.ger Freisetzungswahrscheinlichkeit de
dc.subject.ger der Ca2+-Sensitivität de
dc.subject.ger Wechselwirkung von Synaptotagmin 1 mit Phospholipiden de
dc.subject.eng synaptotagmin de
dc.subject.eng readily releasable pool de
dc.subject.eng release probability de
dc.subject.eng Ca2+ sensitivity de
dc.subject.eng synaptotagmin 1-phospholipid interaction de
dc.subject.bk 42.13 de
dc.identifier.urn urn:nbn:de:gbv:7-webdoc-91-7 de
dc.identifier.purl webdoc-91 de
dc.affiliation.institute Biologische Fakultät inkl. Psychologie de
dc.subject.gokfull W de
dc.identifier.ppn 502072601 de

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