Physikalische und transkriptionelle Kartierung der mit dem Russell-Silver-Syndrom assoziierten Chromosomenregion 17q23-q24

Abstract

Abstract Im Rahmen der positionellen Klonierung eines für das RSS verantwortlichen Gens wurde eine hochauflösende physikalische Karte der Region 17q23-q24 erstellt, da diese Region einen mit dem Russell-Silver-Syndrom (RSS) assoziierten Translokationsbruchpunkt beinhaltet. Dazu wurde zunächst über eine sequence tagged site (STS)-content-Kartierung ein auf YACs basierendes Contig erstellt. Anhand von 5 YACs wurde zudem eine etwa 1,7 Mb umfassende NotI-Restriktionskarte der Bruchpunktregion aufgestellt. Aus einem YAC-Klon, von dem angenommen wurde, daß dieser den Bruchpunkt überspannt, wurde eine Cosmid-Bibliothek konstruiert und anhand der generierten Cosmide eine physikalische EcoRI-Restriktionskarte aus 45 Klonen erstellt. Durch Fluoreszenz-in situ-Hybridisierungen (FISH) mit Cosmiden aus verschiedenen Bereichen des Contigs an Metaphasechromosomen des Probanden AS zeigte sich jedoch, daß sämtliche Cosmide des Contigs proximal zum Translokationsbruchpunkt des Probanden kartieren. Um die in YACs klonierte Bruchpunktregion dennoch weiter eingrenzen zu können, wurde eine humane genomische PAC-Bibliothek durchmustert und 20 PAC-Klone der Region identifiziert, die als positiv für Loci der Region 17q23-q24 verifiziert werden konnten. Diese Klone wurden hinsichtlich ihrer Größe und Lokalisierung charakterisiert und in die hochauflösende physikalische Karte der Bruchpunktregion integriert. Über die durchgeführten Analysen konnten 2 PAC-Klone identifiziert werden, die den Translokationsbruchpunkt des Probanden AS auf Chromosom 17 überspannen. Die etwa 5 Mb genomischer DNA umfassende physikalische Karte enthält 56 Loci, von denen 21 im Verlauf dieser Arbeit über die Sequenzierung von Klon-Endfragmenten generiert wurden. Weiterhin konnte aufgrund der Ergebnisse der STS-content-Kartierung, der Fluoreszenz-in situ-Hybridisierungen (FISH) und der Sequenzierung von PCR-Produkten verschiedener Klone festgestellt werden, daß 8 Loci in der kartierten Region dupliziert vorliegen. Über Datenbankanalysen konnten der Bruchpunktregion 17q23-q24 von Proband AS 11 sequenzierte BACs zugeordnet werden, wobei jedoch kein Klon in der unmittelbaren Umgebung des Bruchpunktes identifiziert wurde. Indem die Sequenzen dieser Klone mit bekannten mRNA-Sequenzen verglichen wurden, konnte die Exon-Intron-Struktur einiger Gene ermittelt werden. Aufgrund von Sequenzvergleichen mit veröffentlichten Daten ließen sich den BACs weiterhin 12 ESTs (expressed sequence tags ) zuordnen, die vorher nicht in der Region kartiert waren. Da 10 % der RSS-Probanden eine maternale uniparentale Disomie von Chromosom 7 (mUPD7) aufweisen und somit nicht für Mutationsanalysen in Kandidatengenen auf Chromosom 17 in Betracht kommen, wurden 29 RSS-Probanden mit 5 polymorphen Markern des Chromosoms 7 analysiert. Über diese Analysen wurde bei 3 Probanden eine mUPD7 festgestellt. Über Sequenzvergleiche mit einer im Rahmen dieser Arbeit generierten STS wurde das Gen Karyopherin a 2 (KPNA2) in der Bruchpunktregion des Probanden AS auf Chromosom 17 kartiert. Dieses Gen wurde im Verlauf dieser Arbeit mit einem maximalen Abstand von 35 kb zum Translokationsbruchpunkt kartiert. Über Sequenzierung der genomischen Sequenz dieses Gens und einen anschließenden Vergleich mit der bekannten mRNA-Sequenz wurde die Exon-Intron-Struktur dieses Gens ermittelt. Anschließend wurde über die Sequenzierung der identifizierten 11 Exons dieses Gens und angrenzender Intronbereiche in 31 RSS-Probanden nach Mutationen gesucht. Über diese Analysen waren keine funktionellen Mutationen feststellbar. Es wurde jedoch eine signifikante Assoziation eines Haplotyps, bestehend aus 6 im KPNA2-Gen lokalisierten Diallelpolymorphismen, mit dem RSS gefunden. Um zu überprüfen, ob ein Teil der RSS-Probanden eine Deletion oder eine uniparentale Disomie (UPD) in der Region 17q23-q24 aufweist, wurde bei 31 RSS-Probanden eine Mikrosatelliten-Analyse mit bis zu 5 Markern der Region durchgeführt. Über diese Analysen konnte jedoch bei keinem Probanden eine Deletion oder UPD nachgewiesen werden. Über FISH-Analysen mit YAC-Klonen des Chromosoms 1 an Metaphasen des Probanden AS wurde der Translokationsbruchpunkt auf Chromosom 1 der Region 1q24 zugeordnet. FISH-Analysen mit YACs und Cosmiden an Metaphasen einer Probandin mit RSS und einer 17;20 Translokation führten zur Kartierung des Bruchpunktes auf Chromosom 17 in der Region 17q25.