Physikalische und transkriptionelle Kartierung der mit dem Russell-Silver-Syndrom assoziierten Chromosomenregion 17q23-q24
Physical and transcriptional mapping of the chromosomal region 17q23-q24 associated with Russell-Silver syndrome
by Sylvia Dörr
Date of Examination:2000-01-27
Date of issue:2001-01-24
Advisor:Prof. Dr. Dr. Wolfgang Engel
Referee:Prof. Dr. Wolfgang Engel
Referee:Prof. Dr. Mireille Schäfer
Files in this item
Name:dissneu.pdf
Size:3.51Mb
Format:PDF
Description:Dissertation
Abstract
Keywords: human genetics; chromosomal mapping; positional cloning
Other Languages
Abstract Im Rahmen der positionellen Klonierung
eines für das RSS verantwortlichen Gens wurde eine
hochauflösende physikalische Karte der Region 17q23-q24
erstellt, da diese Region einen mit dem
Russell-Silver-Syndrom (RSS) assoziierten
Translokationsbruchpunkt beinhaltet. Dazu wurde
zunächst über eine sequence tagged site
(STS)-content-Kartierung ein auf YACs basierendes
Contig erstellt. Anhand von 5 YACs wurde zudem eine
etwa 1,7 Mb umfassende NotI-Restriktionskarte der
Bruchpunktregion aufgestellt. Aus einem YAC-Klon, von
dem angenommen wurde, daß dieser den Bruchpunkt
überspannt, wurde eine Cosmid-Bibliothek konstruiert
und anhand der generierten Cosmide eine physikalische
EcoRI-Restriktionskarte aus 45 Klonen erstellt. Durch
Fluoreszenz-in situ-Hybridisierungen (FISH) mit
Cosmiden aus verschiedenen Bereichen des Contigs an
Metaphasechromosomen des Probanden AS zeigte sich
jedoch, daß sämtliche Cosmide des Contigs proximal zum
Translokationsbruchpunkt des Probanden kartieren. Um
die in YACs klonierte Bruchpunktregion dennoch weiter
eingrenzen zu können, wurde eine humane genomische
PAC-Bibliothek durchmustert und 20 PAC-Klone der Region
identifiziert, die als positiv für Loci der Region
17q23-q24 verifiziert werden konnten. Diese Klone
wurden hinsichtlich ihrer Größe und Lokalisierung
charakterisiert und in die hochauflösende physikalische
Karte der Bruchpunktregion integriert. Über die
durchgeführten Analysen konnten 2 PAC-Klone
identifiziert werden, die den Translokationsbruchpunkt
des Probanden AS auf Chromosom 17 überspannen. Die etwa
5 Mb genomischer DNA umfassende physikalische Karte
enthält 56 Loci, von denen 21 im Verlauf dieser Arbeit
über die Sequenzierung von Klon-Endfragmenten generiert
wurden. Weiterhin konnte aufgrund der Ergebnisse der
STS-content-Kartierung, der Fluoreszenz-in
situ-Hybridisierungen (FISH) und der Sequenzierung von
PCR-Produkten verschiedener Klone festgestellt werden,
daß 8 Loci in der kartierten Region dupliziert
vorliegen. Über Datenbankanalysen konnten der
Bruchpunktregion 17q23-q24 von Proband AS 11
sequenzierte BACs zugeordnet werden, wobei jedoch kein
Klon in der unmittelbaren Umgebung des Bruchpunktes
identifiziert wurde. Indem die Sequenzen dieser Klone
mit bekannten mRNA-Sequenzen verglichen wurden, konnte
die Exon-Intron-Struktur einiger Gene ermittelt werden.
Aufgrund von Sequenzvergleichen mit veröffentlichten
Daten ließen sich den BACs weiterhin 12 ESTs (expressed
sequence tags ) zuordnen, die vorher nicht in der
Region kartiert waren. Da 10 % der RSS-Probanden eine
maternale uniparentale Disomie von Chromosom 7 (mUPD7)
aufweisen und somit nicht für Mutationsanalysen in
Kandidatengenen auf Chromosom 17 in Betracht kommen,
wurden 29 RSS-Probanden mit 5 polymorphen Markern des
Chromosoms 7 analysiert. Über diese Analysen wurde bei
3 Probanden eine mUPD7 festgestellt. Über
Sequenzvergleiche mit einer im Rahmen dieser Arbeit
generierten STS wurde das Gen Karyopherin a 2 (KPNA2)
in der Bruchpunktregion des Probanden AS auf Chromosom
17 kartiert. Dieses Gen wurde im Verlauf dieser Arbeit
mit einem maximalen Abstand von 35 kb zum
Translokationsbruchpunkt kartiert. Über Sequenzierung
der genomischen Sequenz dieses Gens und einen
anschließenden Vergleich mit der bekannten mRNA-Sequenz
wurde die Exon-Intron-Struktur dieses Gens ermittelt.
Anschließend wurde über die Sequenzierung der
identifizierten 11 Exons dieses Gens und angrenzender
Intronbereiche in 31 RSS-Probanden nach Mutationen
gesucht. Über diese Analysen waren keine funktionellen
Mutationen feststellbar. Es wurde jedoch eine
signifikante Assoziation eines Haplotyps, bestehend aus
6 im KPNA2-Gen lokalisierten Diallelpolymorphismen, mit
dem RSS gefunden. Um zu überprüfen, ob ein Teil der
RSS-Probanden eine Deletion oder eine uniparentale
Disomie (UPD) in der Region 17q23-q24 aufweist, wurde
bei 31 RSS-Probanden eine Mikrosatelliten-Analyse mit
bis zu 5 Markern der Region durchgeführt. Über diese
Analysen konnte jedoch bei keinem Probanden eine
Deletion oder UPD nachgewiesen werden. Über
FISH-Analysen mit YAC-Klonen des Chromosoms 1 an
Metaphasen des Probanden AS wurde der
Translokationsbruchpunkt auf Chromosom 1 der Region
1q24 zugeordnet. FISH-Analysen mit YACs und Cosmiden an
Metaphasen einer Probandin mit RSS und einer 17;20
Translokation führten zur Kartierung des Bruchpunktes
auf Chromosom 17 in der Region 17q25.