Identification and Characterization of Microbial Key Functions in Soils of the German Biodiversity Exploratories Representing Different Land Use and Management Types
Identifizierung und Charakterisierung von mikrobiellen Schlüsselfunktionen in Böden unterschiedlichen Landnutzungs- und Managementtyps der deutschen Biodiversitäts-Exploratorien
by Heiko Nacke
Date of Examination:2011-10-20
Date of issue:2012-05-11
Advisor:PD Dr. Rolf Daniel
Referee:PD Dr. Rolf Daniel
Referee:Prof. Dr. Wolfgang Liebl
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Abstract
English
Soil probably harbors the highest microbial species diversity of any environment on Earth and represents a major reservoir of microbial taxonomic, genomic, and metabolic diversity. The most promising approach to gain insights into diversity and structure of soil microbial communities is the application of cultivation-independent techniques. In addition, these techniques are also valuable tools for the recovery of novel natural products from soils. In this study, forest and grassland soil samples derived from the German Biodiversity Exploratories Schorfheide-Chorin, Hainich-Dün, and Schwäbische Alb were analyzed by applying metagenomic approaches. Environmental DNA was isolated from topsoil and subsoil samples covering different management types. Phylogenetic analysis of forest and grassland samples from the Schwäbische Alb (topsoil) and grassland samples from the Hainich (topsoil and subsoil) was performed using 16S rRNA gene-based amplicon pyrosequencing. Bacterial diversity was higher in grassland soils than in forest soils on the phylum level. In addition, a soil depth effect was recorded; topsoil samples exhibited a higher bacterial diversity than subsoil samples. In forest soils, which covered a wide pH range, diversity was significantly influenced by pH and tree species. A high number of bacterial groups showed strong correlations to soil pH at different taxonomic level. This pH effect was not found in Hainich grassland soil samples, because of the small pH range covered by these samples. Instead of pH, organic carbon content induced statistically significant effects on bacterial community structure at the near-neutral pH of the Hainich soil samples. Moreover, 14 plasmid and nine fosmid libraries were constructed from environmental DNA of all three German Biodiversity Exploratories. Partial function-based screening of the metagenomic libraries for lipolytic and (hemi)cellulolytic genes resulted in the identification of 37 unique lipolytic and three individual (hemi)cellulolytic clones. Sequencing and subsequent analysis of insert DNA of these clones was carried out. Thirty-five gene products of the 37 identified lipolytic genes were new members of families I (true lipases), IV, V, VI, and VIII of lipolytic enzymes. The remaining two gene products represent putatively new families of lipolytic enzymes. Insert DNA of two of the three (hemi)cellulolytic clones harbored xylanase-encoding genes whereas insert DNA of the remaining clone contained a cellulase-encoding gene. Amino acid sequence analysis of the gene products revealed that the putative cellulase harbored a family 9 carbohydrate-binding module which was so far only detected in xylanases. Initial characterization of the two xylanases showed that both enzymes exhibit high activity over a wide range of temperatures and pH values. In addition, biochemical characterization of the purified cellulase was performed. The enzyme was highly active over a wide pH range and showed high halotolerance.
Keywords: Soil metagenome; pyrosequencing; bacterial diversity; metagenomic libraries; lipolytic enzymes; (hemi)cellulolytic enzymes
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Boden beherbergt wahrscheinlich die
höchste mikrobielle Artenvielfalt auf der Erde und stellt ein
Hauptreservoir für taxonomische, genomische und metabolische
Vielfalt von Mikroorganismen dar. Der vielversprechendste Ansatz um
Einblicke in die Diversität und Struktur von mikrobiellen
Gemeinschaften des Bodens zu gewinnen, ist die Anwendung von
kultivierungsunabhängigen Methoden. Außerdem sind diese Methoden
wertvoll für die Gewinnung von neuartigen natürlichen Produkten aus
Boden. In dieser Studie wurden Wald- und Grünlandbodenproben aus
den deutschen Biodiversitäts-Exploratorien Schorfheide-Chorin,
Hainich-Dün und Schwäbische Alb mit Hilfe von metagenomischen
Methoden analysiert. Aus Ober- und Unterbodenproben, die
verschiedene Managementtypen abdecken, wurde Umwelt-DNA isoliert.
Durch 16S rRNA Gen-basierte Amplikon Pyrosequenzierung wurde eine
phylogenetische Analyse von Grünland- und Waldproben der
Schwäbischen Alb (Oberboden) und Grünlandproben des Hainichs (Ober-
und Unterboden) ermöglicht. Die bakterielle Diversität war auf der
Phylumebene in Grünlandböden größer als in Waldböden. Außerdem
konnte ein Effekt der Bodentiefe aufgedeckt werden, diesbezüglich
wiesen Oberbodenproben eine höhere Diversität gegenüber
Unterbodenproben auf. Innerhalb der Waldböden, die einen breiten
pH-Bereich abdeckten, konnte ein signifikanter Einfluss des
pH-Wertes sowie der Baumart auf die bakterielle Diversität
nachgewiesen werden. Zahlreiche bakterielle Gruppen zeigten auf
unterschiedlicher taxonomischer Ebene starke Korrelationen
gegenüber dem pH-Wert des Bodens. Dieser pH-Effekt konnte jedoch
nicht in den Hainich-Grünlandbodenproben nachgewiesen werden, da
ein geringer pH-Bereich durch diese Proben abgedeckt wurde.
Stattdessen rief der organische Kohlenstoffgehalt der nahezu
neutralen Hainich-Bodenproben statistisch signifikante Effekte
gegenüber der Struktur der bakteriellen Gemeinschaften hervor.
Unter Verwendung von Umwelt-DNA aus den drei deutschen
Biodiversitäts-Exploratorien wurden 14 Plasmid- und 9 Fosmidbanken
konstruiert. Die partielle Durchmusterung dieser metagenomischen
Genbibliotheken nach lipolytischen und (hemi)cellulolytischen Genen
resultierte in der Identifizierung von 37 unterschiedlichen
lipolytischen Klonen und 3 verschiedenen (hemi)cellulolytischen
Klonen. Die Insert-DNA dieser Klone wurde sequenziert und
anschließend analysiert. Es zeigte sich dass 35 Genprodukte der 37
identifizierten lipolytischen Gene bisher unbekannte Vertreter der
Lipase-/Esterasefamilien I (echte Lipasen), IV, V, VI und VIII
darstellen. Die übrigen beiden Genprodukte repräsentieren Vertreter
potentiell neuer Lipase-/Esterasefamilien. Die Insert-DNA von zwei
der drei (hemi)cellulolytischen Klone beherbergte
Xylanase-kodierende Gene, wogegen die Insert-DNA des übrigen Klones
ein Cellulase-kodierendes Gen beinhaltete. Eine
Aminosäuresequenzanalyse der Genprodukte zeigte, dass die putative
Cellulase eine Kohlenhydratbindedomäne der Familie 9 beherbergt,
die zuvor lediglich in Xylanasen detektiert wurde. Durch initiale
Charakterisierung der beiden Xylanasen konnte ermittelt werden,
dass beide Enzyme eine hohe Aktivität innerhalb eines breiten
Temperatur- und pH-Bereichs aufweisen. Außerdem wurde eine
biochemische Charakterisierung der Cellulase vorgenommen. Das Enzym
war sehr salztolerant und wies eine hohe Aktivität innerhalb eines
breiten pH-Bereichs auf.
Schlagwörter: Bodenmetagenom; Pyrosequenzierung; bakterielle Diversität; metagenomische Genbibliotheken; lipolytische Enzyme; (hemi)cellulolytische Enzyme