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Generation of Novel Photochromic GFPs: Fluorescent Probes for RESOLFT-type Microscopy at Low Light Intensities

Entwicklung neuartiger photochromer GFPs: fluoreszente Marker für die RESOLFT-basierte Mikroskopie bei geringen Lichtintensitäten

by Tim Grotjohann
Doctoral thesis
Date of Examination:2012-04-18
Date of issue:2012-05-23
Advisor:Prof. Dr. Stefan Jakobs
Referee:Prof. Dr. Stefan Jakobs
Referee:Prof. Dr. Kai Tittmann
Referee:Dr. Dieter Klopfenstein
crossref-logoPersistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-1490

 

 

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Name:grotjohann.pdf
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Format:PDF
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Abstract

English

The resolution of a conventional light microscope is limited by diffraction. Hence, light microscopy failed to discern objects that are closer together than half the wavelength of light. STED (STimulated Emission Depletion) microscopy overcame this diffraction resolution barrier for the first time by targeted switching of the fluorescence capability of fluorophores with intense light. This work presents the generation of two novel reversibly switchable fluorescent proteins (RSFPs), namely rsEGFP and rsEGFP2, which enables RESOLFT (REversible Saturable OpticaL Fluorescence Transition) -type super-resolution microscopy of living cells at low levels of light. The unique properties of these proteins overcome the limiting factors which were common to all RSFPs known so far and had therefore impeded their utilization for the RESOLFT approach. The rsEGFP variants exhibit fast switching speeds, low residual fluorescence in the off-state, and most notably, low switching fatigue which allows these proteins to be switched more than a thousand times. The established RSFP-based RESOLFT microscopy approach enables repeated imaging of cytoskeleton structures of living bacteria and mammalian cells as well as the observation of dendrites within an organotypic hippocampal slice of mice at resolution of better than 40 nm. Imaging rates at up to 2 Hz reveal fast movements of peroxisomal vesicles and the ER (Endoplasmic Reticulum) in PtK2 cells by applying about one million times lower light intensities as compared to STED microscopy. Further, the enhanced switching characteristics of rsEGFP facilitate its applicability as a medium for rewritable data storage. By adapting the super-resolution microscopy principle to an all-optical data storage application, a method is presented which allows to write and read data spots in closer proximity than possible with conventional focusing.
Keywords: RESOLFT; rsEGFP; RSFP; reversibly switchable green fluorescent protein; reversibly switchable fluorescent proteins; STED; rsEGFP2; fluorescence microscopy; superresolution microscopy; EGFP

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Die Auflösung eines konventionellen Lichtmikroskops ist durch die Beugungseigenschaften des Lichts limitiert. Daher können Objekte nicht mehr lichtmikroskopisch unterschieden werden, wenn sie näher aneinander liegen als die Hälfte der Wellenlänge des Lichtes. Diese Beugungsgrenze des Lichts wurde erstmalig durch die STED (STimulated Emission Depletion)-Mikroskopie überwunden, indem die Fluoreszenzfähigkeit von Fluorophoren unter Verwendung intensiver Lichtstrahlung gezielt geschaltet wurde. Diese Arbeit beinhaltet die Entwicklung zweier neuartiger Reversibel Schaltbarer Fluoreszierender Proteine (RSFPs), rsEGFP und rsEGFP2, welche die hochauflösende Mikroskopie von lebenden Zellen unter geringen Lichtintensitäten nach dem RESOLFT (Reversible Saturable OpticaL Fluorescence Transition)-Prinzip ermöglichen. Die einzigartigen Eigenschaften dieser Proteine überwinden die limitierenden Faktoren, welche die Verwendung aller bislang bekannten RSFPs im RESOLFT Ansatz verhinderten. Die rsEGFP-Varianten weisen eine hohe Schaltgeschwindigkeit, eine geringe Restfluoreszenz im Aus-Zustand und ein geringes Schaltbleichen auf, weshalb diese Proteine mehr als 1000 mal geschaltet werden können. Der hier etablierte RSFP-basierte RESOLFT-Mikroskopie-Ansatz ermöglicht das wiederholte Abbilden von Zytoskelettstrukturen lebender Bakterien und Säugerzellen, sowie die Beobachtung von Dendriten innerhalb organotypischer Hypocampusschnitte von Mäusen mit einer Auflösung von <40 nm. Bildwiederholungsraten von bis zu 2 Hz dokumentieren schnelle Bewegungen peroxisomaler Vesikel und des ERs (Endoplasmatisches Reticulum) in PtK2 Zellen unter Verwendung von ~ 1.000.000-fach geringeren Lichtintensitäten im Vergleich zur STED-Mikroskopie. Des Weiteren ermöglichen die verbesserten Schalteigenschaften von rsEGFP dessen Anwendung als Medium für wiederbeschreibbare Datenspeicher. Durch die Adaptierung des Prinzips der hochaufgelösten Mikroskopie an optische Datenspeicheranwendungen kann hier eine Methodik präsentiert werden, die das Schreiben und Lesen von Datenpunkten in geringerer Distanz ermöglicht als es konventionelles Fokussieren erlaubt.
Schlagwörter: RESOLFT; rsEGFP; RSFP; reversibel schaltbares grün fluoreszierendes Protein; reversibel schaltbare fluoreszierende Proteine; STED; rsEGFP2; Fluoreszenzmikroskopie; hochauflösende Mikroskopie; EGFP
 

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