Dynamics and interactions of the voltage-dependent anion channel 1 studied by NMR spectroscopy

Abstract

Der spannungsabhängige Anionenkanal (engl. “voltage-dependent anion channel”, VDAC), das häufigste Protein in der äußeren Mitochondrienmembran, dient als wichtiger Kontrollpunkt für den Ein- und Austritt von mitochondrialen Metaboliten und ist in mitochondriale Apoptose involviert. Die kürzliche Bestimmung der hochaufgelösten Struktur durch drei unabhängige Gruppen weist ein 19-strängiges β-Fass mit einer unterschiedlich arrangierten N-terminalen α-Helix in dessen Pore auf. In dieser Arbeit wird die Resonanzzuordnung der Isoform eins des humanen VDAC (VDAC1) in Lösung erweitert. Des Weiteren werden Nachweise für eine geknickte α-helikale Struktur des N-Terminus erbracht, die mit der Kristallstruktur von VDAC1 kompatibel ist, obwohl andere Strukturen nicht ausgeschlossen werden können. Zudem zeigt diese Studie funktionelle Dynamik in VDAC1 mithilfe einer Kombination aus Lösungs-NMR-Spektroskopie, Analyse Gauss’scher Netzwerkmodelle (GNM) und Molekulardynamik-(MD)-Simulationen. Niedrige Signalintensitäten deuten auf das Vorhandensein von Konformationsaustausch im zweiten Teil der N-terminalen α-Helix und dem Linker hin, der die α-Helix mit dem ersten β-Strang verbindet. Zusätzlich beeinflusst die Mutation von Arginin 15 im zweiten α-helikalen Teil die Stabilität der α-Helix und des gesamten β-Fasses in komplexer Weise. In Mizellen ist die Mikro- bis Millisekunden-Dynamik in der N-terminalen α-Helix, dem Linker und den N-terminalen sechs β-Strängen von VDAC1 signifikant erhöht. Außerdem sind die Wasserstoffbrücken der N-terminalen drei β-Stränge instabil. Übereinstimmend zeigen die N-terminalen Stränge erhöhte B-Faktoren in der Kristallstruktur von VDAC1 und durch GNM-Analyse vorhergesagte intrinsische Instabilität. Mutation oder chemische Modifizierung der in die Membran weisenden Glutaminsäure E73 reduzieren die in Lösung auftretende Mikro- bis Millisekunden-Dynamik nachhaltig. MD-Simulationen zeigen, dass eine Ladung an der Seitenkette von E73 für die Erhöhung der N-terminalen Proteindynamik sowie für eine Reduktion der Membrandicke in der Umgebung von E73 verantwortlich ist. Da E73 für die durch Hexokinase induzierte Kanalschließung und Inhibierung von Apoptose notwendig ist, zeigen diese Ergebnisse, dass die Mikro- bis Millisekunden-Dynamik im N-terminalen β-Fassbereich essentiell für Interaktionen und Kanalschließung von VDAC1 ist. Außerdem weisen die Daten auf einen Zusammenhang der Helix-Dynamik mit diesen Prozessen hin. Weiterhin konnten in der vorliegenden Studie zwei Bindungsstellen für das wichtigste Transportsubstrat, ATP, ermittelt werden. Eine dieser Bindungsstellen umfasst die N-terminale α-Helix, den Linker und die nahegelegenen β-Stränge. Die Lokalisierung der ATP-Bindestellen deutet kontrollierten Metabolitenfluss und durch den Liganden induzierte Stabilisierung des offenen Zustands der VDAC1-Pore an. Zum Abschluss zeigt diese Studie, dass Ca2+ mit zwei unterschiedlichen N- und C-terminalen Bereichen des β-Fasses interagiert. Diese Regionen überlappen mit Oligomerisierungsstellen und dynamischen Regionen von VDAC1 und weisen daher auf eine Verbindung zwischen Ca2+-Wechselwirkung, Kanalschließung und Oligomerisierung hin.