α-synuclein in Saccharomyces cerevisiae: model for aggregate clearance, cell survival and influence of autophagy

Abstract

α-Synuclein ist ein neuronal exprimiertes Protein, das an neurodegenerativen Krankheiten wie Morbus Parkinson beteiligt ist. Fehlenhafte Faltung und Akkumulation in zytoplasmatische Einschlusskörper charakterisieren die Pathogenese dieser Krankheit. Diese sind auch durch Überexpression von α-synuclein in Hefezellen nachvollziehbar. In dieser Arbeit wurden das GAL1-Promotor gesteuerte Wildtyp (WT) α-Synuclein mit mehreren Varianten mit und ohne Fluoreszenzmarkierung im Modellsystem Saccharomyces cerevisiae untersucht. Die Überexpression des WT- und A53T-mutierten α-synucleins hemmte das Hefewachstum und resultierte in zytoplasmatischen Aggregaten. C-terminal fluoreszenzmarkierte Varianten zeigten die gleichen Effekte. Die Integration von drei WT- oder zwei A53T-Kopien in einen einzigen genomischen Lokus resultierten in einer signifikanten Wachstumshemmung sowie Akkumulation und wurden somit als Toxizitätsschwelle definiert. Die A30P Variante hatte nur einen gering hemmenden Effekt auf das Hefewachstum und bildete nur transiente Aggregate bei Überexpression. Im Gegensatz dazu zeigte die triple-Prolin-Variante A30P/A56P/A76P weder eine Wachstumshemmung noch nachweisbare Aggregate. Promoterabschaltungsexperimente zeigten, dass Hefezellen Aggregate auflösen können. Das 26S Proteasom spielt bei diesem α-Synuclein Abbau keine wichtige Rolle, da eine Proteasomhemmung durch das Medikament MG132 oder durch eine genetische cim3-1 Mutation die Auflösung der Aggregate wenig beeinflußt. Im Gegensatz dazu fuhrt die Hemmung durch den vakuolaren Proteaseninhibitor Phenylmethylsulfonylfluorid zu einer deutlichen Inhibition bei der Auflösung von α-Synuclein Aggregaten. Ebenso zeigte die Δpep4 Hefemutante eine verminderte Fähigkeit der Aggregatklärung. Die Autophagie-defiziente Hefemutante Δatg1 zeigte eine verzögerte Klärung, was auf eine Beteiligung von Autophagie an dem Prozess schließen lässt. Dies wurde dadurch bestätigt, dass α-synuclein-Aggregate auch reduziert wurden, wenn die Zellen mit dem Autophagie-indu zierenden Medikament Rapamycin behandelt wurden. Rapamycin vorbehandelte Zellen zeigten zusätzlich eine verminderte Aggregatbildung, was die Bedeutung von Autophagie in der α-synuclein Pathobiologie weiter validiert. Im Gegenzug hatte α-Synuclein auch einen Einfluss auf Autophagie. Während A30P α-Synuclein Autophagie transient hoch-regulieren konnte, hatte A53T einen hemmenden Effekt. WT und A53T α-synuclein zusätzlich verzögerten die Induktion von Autophagie. Eine cim3-1Δatg1 Doppelmutante klärte Aggregate nach Promotorabschaltung, was andeutet dass zusätzliche zellulare Mechanismen zur Klärung beitragen müssen. Diese Daten bieten neue Einsichten in die Prozesse, die Hefezellen benutzen um α-synuclein Aggregate zu entfernen und eröffnen neue Perspektiven für therapeutische Eingriffe.