α-synuclein in Saccharomyces cerevisiae: model for aggregate clearance, cell survival and influence of autophagy
α-synuclein in Saccharomyces cerevisiae: model for aggregate clearance, cell survival and influence of autophagy
von Doris Petroi
Datum der mündl. Prüfung:2012-04-20
Erschienen:2012-06-26
Betreuer:Prof. Dr. Gerhard Braus
Gutachter:Prof. Dr. Gerhard Braus
Gutachter:Prof. Dr. Michael Thumm
Gutachter:Prof. Dr. Stefanie Pöggeler
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Size:3.38Mb
Format:PDF
Zusammenfassung
Englisch
α-synuclein is a neuronal protein involved in several neurodegenerative disorders, including Parkinson's Disease (PD). Misfolding and accumulation of α-synuclein into cytoplasmic inclusions correlate with the pathogenesis of PD and are reproducible upon overexpression in yeast. GAL1 promoter-driven wild type (WT) and mutant α-synucleins were studied in parallel with their fluorescently tagged counterparts. Overexpression of WT and of A53T mutant α-synuclein impaired yeast growth and resulted in cytoplasmic accumulations. Fluorescently-tagged versions preserved these effects when the tag was fused C-terminally via a linker. Three WT copies or two A53T copies integrated into one genomic locus resulted in significant growth impairment and accumulation in yeast and represent thresholds for toxicity. A30P mutant α-synuclein had only a mild inhibitory effect to yeast growth and formed aggregates transiently when overexpressed. The triple proline designer mutant A30P/A56P/A76P did not affect growth or formed inclusions. Promoter shut-off experiments revealed that yeast cells can recover from transient α-synuclein expression by clearing aggregates. Proteasomal inhibition by the drug MG132 or by a cim3-1 genetic mutation did not significantly impair aggregate clearance. This suggests only a minor contribution of the 26S proteasome to α-synuclein degradation. In contrast, a major impairment in clearance in yeast cells treated with vacuolar protease inhibitor phenylmethylsulfonyl fluoride suggested a prominent function of vacuolar proteases. Consistently, a Δpep4 yeast mutant characterized by vacuolar defects presented impaired clearance ability. A Δatg1 yeast mutant deficient in autophagy showed a delay in the aggregate clearance response, suggestive of autophagy involvement in the process. α-synuclein aggregates were also cleared when cells were treated with the autophagy-inducing drug rapamycin. Aggregate formation was impaired when cells were pre-treated with the drug, validating the involvement of autophag y in α-synuclein pathobiology. In turn α-synuclein was able to influence autophagy. While A30P α-synuclein transiently up-regulated autophagy, A53T had an inhibitory effect. WT and A53T α-synucleins additionally delayed the induction of autophagy. A cim3-1Δatg1 double mutant cleared α-synuclein aggregates after promoter shut-off, suggesting that additional cellular mechanisms contribute to clearance. These data provide insight into the pathways yeast cells use for clearing Δ-synuclein and offer novel perspectives for therapeutic intervention.
Keywords: α-synuclein; Parkinson's Disease; Aggregates; Autophagy; Yeast
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α-Synuclein ist ein neuronal exprimiertes
Protein, das an neurodegenerativen Krankheiten wie Morbus Parkinson
beteiligt ist. Fehlenhafte Faltung und Akkumulation in
zytoplasmatische Einschlusskörper charakterisieren die Pathogenese
dieser Krankheit. Diese sind auch durch Überexpression von
α-synuclein in Hefezellen nachvollziehbar. In dieser Arbeit wurden
das GAL1-Promotor gesteuerte Wildtyp (WT) α-Synuclein mit mehreren
Varianten mit und ohne Fluoreszenzmarkierung im Modellsystem
Saccharomyces cerevisiae untersucht. Die Überexpression des WT- und
A53T-mutierten α-synucleins hemmte das Hefewachstum und resultierte
in zytoplasmatischen Aggregaten. C-terminal fluoreszenzmarkierte
Varianten zeigten die gleichen Effekte. Die Integration von drei
WT- oder zwei A53T-Kopien in einen einzigen genomischen Lokus
resultierten in einer signifikanten Wachstumshemmung sowie
Akkumulation und wurden somit als Toxizitätsschwelle definiert. Die
A30P Variante hatte nur einen gering hemmenden Effekt auf das
Hefewachstum und bildete nur transiente Aggregate bei
Überexpression. Im Gegensatz dazu zeigte die triple-Prolin-Variante
A30P/A56P/A76P weder eine Wachstumshemmung noch nachweisbare
Aggregate. Promoterabschaltungsexperimente zeigten, dass Hefezellen
Aggregate auflösen können. Das 26S Proteasom spielt bei diesem
α-Synuclein Abbau keine wichtige Rolle, da eine Proteasomhemmung
durch das Medikament MG132 oder durch eine genetische cim3-1
Mutation die Auflösung der Aggregate wenig beeinflußt. Im Gegensatz
dazu fuhrt die Hemmung durch den vakuolaren Proteaseninhibitor
Phenylmethylsulfonylfluorid zu einer deutlichen Inhibition bei der
Auflösung von α-Synuclein Aggregaten. Ebenso zeigte die
Δpep4 Hefemutante eine verminderte Fähigkeit der
Aggregatklärung. Die Autophagie-defiziente Hefemutante Δatg1
zeigte eine verzögerte Klärung, was auf eine Beteiligung von
Autophagie an dem Prozess schließen lässt. Dies wurde dadurch
bestätigt, dass α-synuclein-Aggregate auch reduziert wurden, wenn
die Zellen mit dem Autophagie-indu zierenden Medikament Rapamycin
behandelt wurden. Rapamycin vorbehandelte Zellen zeigten zusätzlich
eine verminderte Aggregatbildung, was die Bedeutung von Autophagie
in der α-synuclein Pathobiologie weiter validiert. Im Gegenzug
hatte α-Synuclein auch einen Einfluss auf Autophagie. Während A30P
α-Synuclein Autophagie transient hoch-regulieren konnte, hatte A53T
einen hemmenden Effekt. WT und A53T α-synuclein zusätzlich
verzögerten die Induktion von Autophagie. Eine cim3-1Δatg1
Doppelmutante klärte Aggregate nach Promotorabschaltung, was
andeutet dass zusätzliche zellulare Mechanismen zur Klärung
beitragen müssen. Diese Daten bieten neue Einsichten in die
Prozesse, die Hefezellen benutzen um α-synuclein Aggregate zu
entfernen und eröffnen neue Perspektiven für therapeutische
Eingriffe.
Schlagwörter: α-Synuclein; Morbus Parkinson; Aggregate; Autophagie; Hefe