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α-synuclein in Saccharomyces cerevisiae: model for aggregate clearance, cell survival and influence of autophagy

dc.contributor.advisorBraus, Gerhard Prof. Dr.de
dc.contributor.authorPetroi, Dorisde
dc.date.accessioned2013-01-14T15:06:03Zde
dc.date.available2013-01-30T23:50:52Zde
dc.date.issued2012-06-26de
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-000D-EF63-0de
dc.identifier.urihttp://dx.doi.org/10.53846/goediss-1432
dc.description.abstractα-Synuclein ist ein neuronal exprimiertes Protein, das an neurodegenerativen Krankheiten wie Morbus Parkinson beteiligt ist. Fehlenhafte Faltung und Akkumulation in zytoplasmatische Einschlusskörper charakterisieren die Pathogenese dieser Krankheit. Diese sind auch durch Überexpression von α-synuclein in Hefezellen nachvollziehbar. In dieser Arbeit wurden das GAL1-Promotor gesteuerte Wildtyp (WT) α-Synuclein mit mehreren Varianten mit und ohne Fluoreszenzmarkierung im Modellsystem Saccharomyces cerevisiae untersucht. Die Überexpression des WT- und A53T-mutierten α-synucleins hemmte das Hefewachstum und resultierte in zytoplasmatischen Aggregaten. C-terminal fluoreszenzmarkierte Varianten zeigten die gleichen Effekte. Die Integration von drei WT- oder zwei A53T-Kopien in einen einzigen genomischen Lokus resultierten in einer signifikanten Wachstumshemmung sowie Akkumulation und wurden somit als Toxizitätsschwelle definiert. Die A30P Variante hatte nur einen gering hemmenden Effekt auf das Hefewachstum und bildete nur transiente Aggregate bei Überexpression. Im Gegensatz dazu zeigte die triple-Prolin-Variante A30P/A56P/A76P weder eine Wachstumshemmung noch nachweisbare Aggregate. Promoterabschaltungsexperimente zeigten, dass Hefezellen Aggregate auflösen können. Das 26S Proteasom spielt bei diesem α-Synuclein Abbau keine wichtige Rolle, da eine Proteasomhemmung durch das Medikament MG132 oder durch eine genetische cim3-1 Mutation die Auflösung der Aggregate wenig beeinflußt. Im Gegensatz dazu fuhrt die Hemmung durch den vakuolaren Proteaseninhibitor Phenylmethylsulfonylfluorid zu einer deutlichen Inhibition bei der Auflösung von α-Synuclein Aggregaten. Ebenso zeigte die Δpep4 Hefemutante eine verminderte Fähigkeit der Aggregatklärung. Die Autophagie-defiziente Hefemutante Δatg1 zeigte eine verzögerte Klärung, was auf eine Beteiligung von Autophagie an dem Prozess schließen lässt. Dies wurde dadurch bestätigt, dass α-synuclein-Aggregate auch reduziert wurden, wenn die Zellen mit dem Autophagie-indu zierenden Medikament Rapamycin behandelt wurden. Rapamycin vorbehandelte Zellen zeigten zusätzlich eine verminderte Aggregatbildung, was die Bedeutung von Autophagie in der α-synuclein Pathobiologie weiter validiert. Im Gegenzug hatte α-Synuclein auch einen Einfluss auf Autophagie. Während A30P α-Synuclein Autophagie transient hoch-regulieren konnte, hatte A53T einen hemmenden Effekt. WT und A53T α-synuclein zusätzlich verzögerten die Induktion von Autophagie. Eine cim3-1Δatg1 Doppelmutante klärte Aggregate nach Promotorabschaltung, was andeutet dass zusätzliche zellulare Mechanismen zur Klärung beitragen müssen. Diese Daten bieten neue Einsichten in die Prozesse, die Hefezellen benutzen um α-synuclein Aggregate zu entfernen und eröffnen neue Perspektiven für therapeutische Eingriffe.de
dc.format.mimetypeapplication/pdfde
dc.language.isoengde
dc.rights.urihttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/de
dc.titleα-synuclein in Saccharomyces cerevisiae: model for aggregate clearance, cell survival and influence of autophagyde
dc.typedoctoralThesisde
dc.title.translatedα-synuclein in Saccharomyces cerevisiae: model for aggregate clearance, cell survival and influence of autophagyde
dc.contributor.refereeBraus, Gerhard Prof. Dr.de
dc.date.examination2012-04-20de
dc.subject.dnb570 Biowissenschaften, Biologiede
dc.subject.gokWF 200 Molekularbiologiede
dc.description.abstractengα-synuclein is a neuronal protein involved in several neurodegenerative disorders, including Parkinson's Disease (PD). Misfolding and accumulation of α-synuclein into cytoplasmic inclusions correlate with the pathogenesis of PD and are reproducible upon overexpression in yeast. GAL1 promoter-driven wild type (WT) and mutant α-synucleins were studied in parallel with their fluorescently tagged counterparts. Overexpression of WT and of A53T mutant α-synuclein impaired yeast growth and resulted in cytoplasmic accumulations. Fluorescently-tagged versions preserved these effects when the tag was fused C-terminally via a linker. Three WT copies or two A53T copies integrated into one genomic locus resulted in significant growth impairment and accumulation in yeast and represent thresholds for toxicity. A30P mutant α-synuclein had only a mild inhibitory effect to yeast growth and formed aggregates transiently when overexpressed. The triple proline designer mutant A30P/A56P/A76P did not affect growth or formed inclusions. Promoter shut-off experiments revealed that yeast cells can recover from transient α-synuclein expression by clearing aggregates. Proteasomal inhibition by the drug MG132 or by a cim3-1 genetic mutation did not significantly impair aggregate clearance. This suggests only a minor contribution of the 26S proteasome to α-synuclein degradation. In contrast, a major impairment in clearance in yeast cells treated with vacuolar protease inhibitor phenylmethylsulfonyl fluoride suggested a prominent function of vacuolar proteases. Consistently, a Δpep4 yeast mutant characterized by vacuolar defects presented impaired clearance ability. A Δatg1 yeast mutant deficient in autophagy showed a delay in the aggregate clearance response, suggestive of autophagy involvement in the process. α-synuclein aggregates were also cleared when cells were treated with the autophagy-inducing drug rapamycin. Aggregate formation was impaired when cells were pre-treated with the drug, validating the involvement of autophag y in α-synuclein pathobiology. In turn α-synuclein was able to influence autophagy. While A30P α-synuclein transiently up-regulated autophagy, A53T had an inhibitory effect. WT and A53T α-synucleins additionally delayed the induction of autophagy. A cim3-1Δatg1 double mutant cleared α-synuclein aggregates after promoter shut-off, suggesting that additional cellular mechanisms contribute to clearance. These data provide insight into the pathways yeast cells use for clearing Δ-synuclein and offer novel perspectives for therapeutic intervention.de
dc.contributor.coRefereeThumm, Michael Prof. Dr.de
dc.contributor.thirdRefereePöggeler, Stefanie Prof. Dr.de
dc.subject.topicBiology (incl. Psychology)de
dc.subject.gerα-Synucleinde
dc.subject.gerMorbus Parkinsonde
dc.subject.gerAggregatede
dc.subject.gerAutophagiede
dc.subject.gerHefede
dc.subject.engα-synucleinde
dc.subject.engParkinson's Diseasede
dc.subject.engAggregatesde
dc.subject.engAutophagyde
dc.subject.engYeastde
dc.subject.bk42 Biologiede
dc.identifier.urnurn:nbn:de:gbv:7-webdoc-3585-9de
dc.identifier.purlwebdoc-3585de
dc.affiliation.instituteBiologische Fakultätde
dc.identifier.ppn72647052Xde


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