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Characterization of the neuronal proteolipids M6A and M6B and the oligodendroglial tetraspans PLP and TSPAN2 in neural cell process formation

Charakterisierung der neuronalen Proteolipide M6A und M6B und der oligodendroglialen Viertransmembranproteine PLP und TSPAN2 in der Bildung von neuralen zellulären Fortsätzen

by Patricia Irene de Monasterio Schrader
Doctoral thesis
Date of Examination:2011-07-20
Date of issue:2012-07-12
Advisor:Prof. Dr. Klaus-Armin Nave
Referee:Prof. Dr. Klaus-Armin Nave
Referee:Prof. Dr. Gregor Bucher
Referee:Dr. Dieter Klopfenstein
crossref-logoPersistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-1450

 

 

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Abstract

English

The tetraspan-transmembrane proteins of the M6-proteolipid proteolipid protein family are among the most abundant cell surface proteins in neurons. Their cellular function has remained largely speculative, also because their analysis has been limited to acute alterations of their abundance levels in vitro. Based on expression analyses I have hypothesized that neuronal M6 proteolipids have a role in neuronal development. Indeed, the results presented in this thesis show that M6A defines an F-actin-free structural compartment at the tip of axonal growth cones while its homolog M6B is mainly present at actin-rich neurite domains. For the analysis of neurite extension upon chronic deficiency of M6-proteins, single-mutant M6Anull and M6Bnull mice and M6Anull*M6Bnull double-mutants were characterized. Importantly, lack of either neuronal M6-protein impaired the extension of neurites from cultured cortical neurons ex vivo. Mutant growth cones showed abnormal compartmentalization and did not display normal growth cone collapse upon ephrinA5-application. The mechanism of action is likely to involve Eph-receptor signalling, as the abundance of the effector molecule ephexin-1 is considerably reduced in the absence of M6-proteins. Preliminary analysis shows that the formation of neuronal processes is also impaired in vivo, at least affecting the long-projecting cortical neurons traversing the corpus callosum at an early postnatal stage. Together, M6-proteolipids contribute to the structural organization of neuronal growth cones that is prerequisite for normal reaction to guidance cues and neurite extension. The third member of the M6-proteolipid proteolipid protein family, termed PLP, is the most abundant protein of CNS myelin. It has been surprising that myelin biogenesis is not obviously impaired in PLPnull mice. In a candidate approach the structurally related tetraspan tetraspanin-2 (TSPAN2), a known low-abundant myelin protein, was identified as a candidate to compensate for PLP-deficiency because of its considerably increased abundance in PLPnull myelin. To investigate the role of TSPAN2 in myelination, I generated TSPAN2null mutant mice by homologous recombination in embryonic stem cells and TSPAN2null*PLPnull double-mutant mice were bred. These mice are viable and fertile. Interestingly, the initial examination shows that the abundance of the closely related tetraspanin CD81 is increased in TSPAN2null myelin, signifying a molecular change that may compensate for the absence of TSPAN2 function. Considering their spatio-temporal expression and that overexpression studies hint to a role of TSPAN2 and PLP in oligodendroglial processes formation it is likely that tetraspans of various protein families have overlapping and partially redundant functions as molecular facilitators of myelination.
Keywords: central nervous system; neuron; growth cone; proteolipid; M6-proteins; M6A; M6B; PLP; Ephrin; F-actin; filopodia; lamellipodia; neurite extension; myelin oligodendrocyte; tetraspanin; TSPAN2; null mutant mice

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M6-Proteine der Proteolipid-Proteinfamilie mit vier Transmembrandomänen gehören zu den abundantesten Zelloberflächenproteinen in Neuronen. Ihre zelluläre Funktion ist weitgehend spekulativ, auch weil deren Analyse sich auf akute Veränderungen der Abundanzniveaus in vitro beschränkt hat. Beruhend auf Expressionsanalysen habe ich die Hypothese aufgestellt, dass M6-Proteolipide eine Rolle in der neuronalen Entwicklung spielen. In der Tat zeigen die Ergebnisse die in dieser Dissertation präsentiert werden, dass M6A ein F-Aktin freies strukturelles Kompartiment an der Spitze der axonalen Wachstumskegel definiert, während dessen Homolog M6B hauptsächlich in Aktin-reichen Domänen in Neuriten vorhanden ist. Zur Analyse des Neuritenwachstums bei chronischer Defizienz der M6-Proteine wurden M6Anull bzw. M6Bnull einzelmutante Mäuse, sowie M6Anull*M6Bnull doppelmutante Mäuse charakterisiert. Bemerkenswert ist, dass das Fehlen bereits eines der beiden M6-Proteine das Neuritenwachstum kultivierter kortikaler Neuronen ex vivo reduzierte. Mutante Wachstumskegel zeigten abnormale Kompartimentalisierung und verminderten Kollaps nach Induktion durch EphrinA5. Der Mechanismus bezieht wahrscheinlich Signalübertragung über Eph-Rezeptoren ein, da die Abundanz des Effektormoleküls Ephexin-1 in der Abwesenheit von M6-Proteinen deutlich verringert ist. Meine Analysen ergaben Hinweise, dass die Entstehung neuronaler Prozesse auch in vivo beeinträchtigt ist, und sich zumindest in einem frühen postnatalen Stadium auf die kortikalen Neuronen die mit ihren langen Projektionen den Corpus Callosum durchqueren auswirkt. Demzufolge, tragen M6-Protelipide zu der strukturellen Organisation neuronaler Wachstumskegel bei, eine Vorraussetzung für die normale Reaktion auf Lenkungsmoleküle während des Neuritenwachstums. Das dritte Mitglied der Proteolipid-Proteinfamilie, als PLP bezeichnet, ist das abundanteste Protein des ZNS Myelins. Überraschender Weise ist die Myelinbiogenese in PLPnull Mäusen nur geringfügig beeinträchtigt. Auf Grund seiner deutlich erhöhten Abundanz im PLPnull Myelin wurde das strukturell verwandte Viertransmembranprotein Tetraspanin-2 (TSPAN2), ein niedrig abundantes Myelinprotein, als ein Kandidat für die Kompensierung der PLP-Abwesenheit identifiziert. Um die Funktion des TSPAN2 in der Myelinisierung zu untersuchen, habe ich TSPAN2null mutante Mäuse mittels homologer Rekombination in embryonalen Stammzellen generiert und TSPAN2null*PLPnull doppelmutante Mäuse gezüchtet. Diese Mäuse sind lebensfähig und fruchtbar. Interessanterweise zeigen meine Erstanalysen, dass die Abundanz des nahe verwandten Tetraspanins CD81 in dem TSPAN2null Myelin erhöht ist, was auf eine molekulare Veränderung deutet, die für die Abwesenheit der TSPAN2 Funktion kompensieren konnte. In Anbetracht der räumlich-zeitlichen Expression und der Überexpressionsstudien, die auf eine Rolle von TSPAN2 und PLP in der Bildung der zellulären Fortsätze in Oligodendrozyten deuten, ist es wahrscheinlich, dass Viertransmembranproteine verschiedener Proteinfamilien überlappende und partiell redundante Funktionen während der Myelinisierung haben.
Schlagwörter: Zentrales Nervensystem; Neuron; Wachstumskegel; Proteolipide; M6-Proteine; M6A; M6B; PLP; Ephrine; F-Aktin; Filopodia; Lamellipodia; Neuritenwachstum; Myelin; Oligodendrozyte; Tetraspanin; TSPAN2; Nullmutante Maus
 

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