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Zirkulierende Nukleinsäuren als molekulare Marker zur Trächtigkeitsbestimmung beim Rind

Circulating nucleic acids as molecular marker for pregnancy detection in cattle

by Jennifer Mayer
Doctoral thesis
Date of Examination:2012-06-26
Date of issue:2012-07-12
Advisor:Prof. Dr. Dr. Bertram Brenig
Referee:Prof. Dr. Rainer Willmann
Referee:Prof. Dr. Dr. Bertram Brenig
Referee:Prof. Dr. Gabriele Hörstgen-Schwark
crossref-logoPersistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-1452

 

 

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Abstract

English

Circulating nucleic acids (CNAs) are specified as DNAs and RNAs outside cells that are circulating in the blood free or wrapped in membrane vesicles of healthy and diseased individuals. In this study CNA profiles from serum samples of pregnant and non pregnant dairy cows were generated for early days post fertilization (dpf). These CNAs should be used as potential biomarkers reflecting the molecular genetic mechanisms in cellular differentiation of the reproductive tissues. CNAs were preprocessed using a modified SuperSAGE (Serial Analysis of Gene Expression) technique. Short sequence tags were generated and sequenced by using Roche/454 GS FLX Titanium application. Analysis of the 454 data revealed significant differences for the distribution of tag hits at specific chromosomal regions as well as for repetitive elements. Using specific LINE/SINE repeats qPCR by combining distinct tag sequences in one assay the observed differences during pregnancy were confirmed. ROC analysis was used to evaluate the qPCR results. At 20 23 dpf the Art2A and BovB assays showed a sensitivity of 63 % 71 % and a specificity of 83 % 86 %, respectively. The best performing results were obtained for tag 2 and tag 3 combination of the BovB repeat (2_3_BovB qPCR). Additionally, methylation patterns were detected by endonuclease restriction and SOLiDTM sequencing. This epigenetic approach characterized pregnancy associated CNA profiles in cows. The analysis of SOLiDTM sequencing data showed significant group differences regarding methylation grade of sequence hits at well defined chromosomal regions and gene sequences. This analysis led to the identification of genes, clearly associated with processes of developments during the course of pregnancy. In summary specific CNA fragment were identified, which are associated with pregnancy and originate most likely from growing placental tissues.
Keywords: circulating nucleic acids; bovine pregnancy; next generation sequencing; SAGE; methylation patterns; repetitive elements; serum; dairy cows

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Zirkulierende Nukleinsäuren (CNAs) sind sowohl DNA, als auch RNA Moleküle, die im Blutkreislauf von gesunden und erkrankten Individuen als freie oder in Mikrovesikeln verpackte Nukleinsäuren existieren. In dieser Arbeit wurden CNA Profile im Serum trächtiger und nicht trächtiger Kühe zu einem frühen Zeitpunkt post inseminationem (p.i.) erstellt. Dabei sollten diese CNAs als potentielle Biomarker die molekulargenetischen Differenzierungsprozesse im reproduktiven Gewebe widerspiegeln. Die CNAs wurden mit einem modifizierten SuperSAGE Verfahren (Serial Analysis of Gene Expression) aufbereitet. Dabei wurden kurze Sequenzabschnitte (Tags) generiert und anschließend mit dem Roche/454 GS FLX Titanium sequenziert. Die Auswertung der 454 Sequenzierungsdaten ergab in der Verteilung der Tag Treffer auf definierten Bereichen der bovinen Chromosomen, sowie auf repetitiven Elementen signifikante Unterschiede zwischen Proben trächtiger und nicht trächtiger Kühe. Die anschließende Validierung der repetitiven Tag Sequenzen bestätigten diese Gruppenunterschiede. Mit Hilfe der ROC Analyse wurden die qPCR Ergebnisse bewertet. Dabei wurden für die Art2A und BovB Fragmente am d 20 23 p.i. eine Richtig Positiv Rate von 63 % 71 % der trächtigen Kühe sowie eine Richtig Negativ Rate von 83 % 86 % ermittelt. Die besten Resultate wies dabei das 2_3_BovB qPCR Experiment auf. Zusätzlich erfolgte eine epigenetische Untersuchung der CNA Methylierungsmuster mit Hilfe von Restriktionsendonukleasen und der SOLiDTM Sequenzierung. Die Analyse der SOLiDTM Sequenzierungsdaten ergab für den frühen Trächtigkeitsverlauf Unterschiede im Methylierungsgrad von Sequenz Treffern innerhalb von definierten chromosomalen Regionen und in Gen Bereichen. Dabei wurden Gene ermittelt, die mit Entwicklungsprozessen während des Trächtigkeitsverlaufes assoziiert werden konnten. Insgesamt konnten spezifische CNA Fragmente identifiziert werden, die mit einer Trächtigkeit assoziiert sind und mit großer Wahrscheinlichkeit vom wachsenden Gewebe der Plazenta entstammten.
Schlagwörter: zirkulierende Nukleinsäuren; Trächtigkeit; Next Generation Sequencing; SAGE; Methylierung; repetitive Elemente; Serum; Kuh
 

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