Deneddylation and fungal development - Regulation of Nedd8 protein modification by DenA and the COP9 signalosome

Abstract

Der Abbau von Proteinen durch das Ubiquitin-Proteasome System ist ein Mechanismus mit zentraler Bedeutung für die korrekte Steuerung unterschiedlicher zelluläre Prozesse. Fehlregulation führt bei Pflanzen, Insekten und Säugetieren bereits im Embryonalstadium zum Absterben des Organismus und ist an der Entstehung einiger Formen von Krebs beteiligt. Die spezifische Markierung von Zielproteinen mit Ubiquitin benötigt die Aktivität von E3-Ligasen. Die größte Gruppe dieser Enzyme enthält ein Cullin als zentrales Element. Diese Art von Ligasen wird in ihrer Aktivität und Stabilität durch das kleine, Ubiquitin-ähnliche Protein Nedd8 reguliert. Das COP9 Signalosome (CSN) und die humane Deneddylase 1 (DEN1) sind die häufigsten Proteasen, die diese Modifikation rückgängig machen. In dieser Arbeit wurde die Rolle der beiden Deneddylasen für die Entwicklung des filamentösen Pilzes Aspergillus nidulans untersucht. (i) Das homologe Protein zu humanem DEN1 im Pilz, DenA, konnte identifiziert werden und seine Rolle für die Fruchtkörperbildung wurde untersucht. DenA spielt eine wichtige Rolle bei der lichtabhängigen Förderung asexueller Entwicklung und bei der Repremierung der sexuellen Fruchtkörperbildung im Licht. Genetische Studien, sowie Ergebnisse aus biochemischen und molekularen Experimenten zeigen deutlich das DenA Deneddylaseaktivität besitzt. Deletiert man beide Deneddylasen, csnE und denA, ist der entsprechende Stamm zu keiner Fruchtkörperbildung mehr fähig, wächst jedoch noch vegetativ, was auf eine teilweise Funktionsüberschneidung zwischen beiden Proteasen hinweist. Beide Einzelmutanten zeigen spezifische Phänotypen, aber gleichen sich in der Eigenschaft, die Initiierung sexueller Entwicklung im Licht nicht mehr unterdrücken zu können. Diese Verbindung zeigt sich auch in Form einer physischen Interaktion zwischen dem CSN Komplex und DenA welche möglicherweise dazu dient die Balance zwischen beiden Proteasen zu kontrollieren. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen das Deneddylierung eine wichtige Rolle bei der Koordinierung von Entwicklung im Pilz spielt. DenA beeinflusst vorrangig die asexuelle Sporenbildung, während das CSN für die sexuelle Fruchtkörperentwicklung wichtig ist. Beide Deneddylasen beeinflussen die Lichtregulation der sexuellen Entwicklung. (ii) Der CSN Komplex wurde hinsichtlich der Dynamik des Zusammenbaus untersucht. Hierzu wurden Aufreinigungsexperimente mit modifizierten, funktionellen Versionen der Untereinheiten CsnA und CsnD durchgeführt. In Aufreinigungen mit CsnA konnten die meisten CSN Untereinheiten identifiziert werden, mit Ausnahme der enzymatisch aktiven Untereinheit CsnE. CsnD interagierte, ohne Ausnahme, mit allen anderen CSN Untereinheiten, verlor diese Interaktion jedoch komplett nachdem csnG im entsprechenden Stamm deletiert wurde. Dies lässt vermuten, dass das CSN im Pilz primär als Gesamtkomplex vorliegt, während kleinere Unterkomplexe in der Zelle nicht stabil sind.