Structural and Funtional Studies on VitaminB1-Dependent Human and Bacterial Transketolases

Abstract

Transketolasen (TKs, EC 2.2.1.1) sind ubiquitär vorkommende Enzyme des Kohlenhydratstoffwechsels, die für ihre katalytische Aktivität den Kofaktor Thiamindiphosphat benötigen. TKs sind an einer Vielzahl von Stoffwechselwegen beteiligt, wobei der Calvinzyklus und der Pentosephosphatweg die wichtigsten Beispiele darstellen. Letzterer Stoffwechselzweig generiert Intermediate für andere metabolische Wege wie die Biosynthese von Nukleotiden, aromatischen Aminosäuren oder Vitaminen und ermöglicht Zellen damit eine flexible Anpassung an verschiedene metabolische Anforderungen. Zudem produziert der Pentosephosphatweg NADPH für die Aufrechterhaltung des Gluthathionspiegels und reduktive Biosynthesen von Cholesterol und Fettsäuren. TKs katalysieren den reversiblen Transfer eines Dihydroxyethylfragments von einer Donorketose auf die C1-Position einer Akzeptoraldose wobei zahlreiche kovalente und nichtkovalente Substrat-Kofaktorintermediate stabilisiert werden. Aktuelle, strukturelle Ergebnisse zeigten, dass Molekülspannung innerhalb kovalenter Reaktionsintermediate aber auch in komplexierten Akzeptorzuckern einen wichtigen katalytischen Einfluss für die Triebkraft der Transketolasereaktion darstellen. Dies ist vermutlich ein allgemeines Prinzip Thiamindiphosphate-abhängiger Enzyme und sollte eingehend anhand der Transketolase untersucht werden. Die vorliegende Doktorarbeit präsentiert eine umfassende Strukturanalyse von Reaktionsintermediaten, die transient entlang der Reaktionskoordinate von humaner sowie bakterieller (Escherichia coli) Transketolase gebildet werden und korreliert strukturelle Eigenschaften von Intermediaten mit deren chemischer Reaktivität. Durch die Kombination von hochauflösender Röntgenkristallographie mit kinetischen und biophysikalischen Methoden wird ein detailliertes Bild der Reaktion von Transketolase gezeichnet. TK im Komplex mit allen nativen, kovalenten Reaktionsintermediaten konnte bei wahrer Atomizität strukturell bestimmt werden was die eindeutige Zuordnung von Protonierungszuständen und die Visualisierung kleinster geometrischer Distorsionen erlaubt. All diese Intermediate weisen signifikante Winkelspannungen für die C-C-Bindung auf, die Substrat und Kofaktor verbindet, was frühere Beobachtungen zu analogen Strukturen bestätigt. Winkelspannungen sind weiterhin für beide aromatische Ringsysteme des Kofaktor beobachtbar, was den Schluss zulässt, dass die gesamten Intermediatstrukturen gespannt und hochenergetisch sind. TK treibt die selektive Spaltung von C-C-Bindungen durch eine Anpassung des pKa von Resten des aktiven Zentrums sowie einer Weitung der zu spaltenden Bindung. Solch eine spezifische Bindungsverlängerung ist mit einer Verringerung der Bindungsdissoziationsenergie verbunden und könnte damit die Spaltung der Bindung dramatisch beschleunigen. Dies ist eine noch nie dagewesene Beobachtung für ein enzymatisches Reaktionsintermediat. Die Anpassung dieses Enzyms zahlreiche Intermediate verschiedener Kettenlänge zu binden und zu stabilisieren wird durch ein konserviertes Netz polare Wechselwirkungen zwischen dem aktiven Zentrum sowie dem Substratanteil der Intermediate realisiert. Das aktive Zentrum von Transketolase scheint für alle Reaktionsschritte bereits ausgerichtet zu sein, da keinerlei strukturellen Veränderung der Reste des aktiven Zentrums während der Substratumwandlung auftreten.