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Structural and Funtional Studies on VitaminB1-Dependent Human and Bacterial Transketolases

dc.contributor.advisorTittmann, Kai Prof. Dr.de
dc.contributor.authorLüdtke, Stefande
dc.date.accessioned2013-01-14T15:07:42Zde
dc.date.available2013-05-21T22:50:04Zde
dc.date.issued2012-08-24de
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-000D-EF71-0de
dc.identifier.urihttp://dx.doi.org/10.53846/goediss-1484
dc.description.abstractTransketolasen (TKs, EC 2.2.1.1) sind ubiquitär vorkommende Enzyme des Kohlenhydratstoffwechsels, die für ihre katalytische Aktivität den Kofaktor Thiamindiphosphat benötigen. TKs sind an einer Vielzahl von Stoffwechselwegen beteiligt, wobei der Calvinzyklus und der Pentosephosphatweg die wichtigsten Beispiele darstellen. Letzterer Stoffwechselzweig generiert Intermediate für andere metabolische Wege wie die Biosynthese von Nukleotiden, aromatischen Aminosäuren oder Vitaminen und ermöglicht Zellen damit eine flexible Anpassung an verschiedene metabolische Anforderungen. Zudem produziert der Pentosephosphatweg NADPH für die Aufrechterhaltung des Gluthathionspiegels und reduktive Biosynthesen von Cholesterol und Fettsäuren. TKs katalysieren den reversiblen Transfer eines Dihydroxyethylfragments von einer Donorketose auf die C1-Position einer Akzeptoraldose wobei zahlreiche kovalente und nichtkovalente Substrat-Kofaktorintermediate stabilisiert werden. Aktuelle, strukturelle Ergebnisse zeigten, dass Molekülspannung innerhalb kovalenter Reaktionsintermediate aber auch in komplexierten Akzeptorzuckern einen wichtigen katalytischen Einfluss für die Triebkraft der Transketolasereaktion darstellen. Dies ist vermutlich ein allgemeines Prinzip Thiamindiphosphate-abhängiger Enzyme und sollte eingehend anhand der Transketolase untersucht werden. Die vorliegende Doktorarbeit präsentiert eine umfassende Strukturanalyse von Reaktionsintermediaten, die transient entlang der Reaktionskoordinate von humaner sowie bakterieller (Escherichia coli) Transketolase gebildet werden und korreliert strukturelle Eigenschaften von Intermediaten mit deren chemischer Reaktivität. Durch die Kombination von hochauflösender Röntgenkristallographie mit kinetischen und biophysikalischen Methoden wird ein detailliertes Bild der Reaktion von Transketolase gezeichnet. TK im Komplex mit allen nativen, kovalenten Reaktionsintermediaten konnte bei wahrer Atomizität strukturell bestimmt werden was die eindeutige Zuordnung von Protonierungszuständen und die Visualisierung kleinster geometrischer Distorsionen erlaubt. All diese Intermediate weisen signifikante Winkelspannungen für die C-C-Bindung auf, die Substrat und Kofaktor verbindet, was frühere Beobachtungen zu analogen Strukturen bestätigt. Winkelspannungen sind weiterhin für beide aromatische Ringsysteme des Kofaktor beobachtbar, was den Schluss zulässt, dass die gesamten Intermediatstrukturen gespannt und hochenergetisch sind. TK treibt die selektive Spaltung von C-C-Bindungen durch eine Anpassung des pKa von Resten des aktiven Zentrums sowie einer Weitung der zu spaltenden Bindung. Solch eine spezifische Bindungsverlängerung ist mit einer Verringerung der Bindungsdissoziationsenergie verbunden und könnte damit die Spaltung der Bindung dramatisch beschleunigen. Dies ist eine noch nie dagewesene Beobachtung für ein enzymatisches Reaktionsintermediat. Die Anpassung dieses Enzyms zahlreiche Intermediate verschiedener Kettenlänge zu binden und zu stabilisieren wird durch ein konserviertes Netz polare Wechselwirkungen zwischen dem aktiven Zentrum sowie dem Substratanteil der Intermediate realisiert. Das aktive Zentrum von Transketolase scheint für alle Reaktionsschritte bereits ausgerichtet zu sein, da keinerlei strukturellen Veränderung der Reste des aktiven Zentrums während der Substratumwandlung auftreten.de
dc.format.mimetypeapplication/pdfde
dc.language.isoengde
dc.rights.urihttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/de
dc.titleStructural and Funtional Studies on VitaminB1-Dependent Human and Bacterial Transketolasesde
dc.typedoctoralThesisde
dc.title.translatedStrukturelle und Funktionelle Untersuchungen an humaner und bakterieller, Vitamin B1-abhängiger Transketolasede
dc.contributor.refereeTittmann, Kai Prof. Dr.de
dc.date.examination2012-05-22de
dc.subject.dnb570 Biowissenschaften, Biologiede
dc.subject.gokSX 000de
dc.subject.gokSXB 000de
dc.subject.gokSXC 000de
dc.description.abstractengTransketolases (TKs, EC 2.2.1.1) are ubiquitous enzymes in cellular carbohydrate metabolism that require the cofactor thiamin diphosphate for catalytic activity. TKs are involved in numerous metabolic pathways whereas the by far most important ones are the Calvin cycle and the pentose-phosphate pathway. The later permits cells a flexible adaptation to different metabolic needs as it supplies intermediates for the biosynthesis of nucleotides, aromatic amino acids, and vitamins. Additionally, it produces NADPH for sustaining the glutathione level and for reductive biosynthetic pathways of e.g. cholesterol and fatty acids. TKs catalyze the reversible transfer of a dihydroxyethyl-fragment from a donor ketose to an acceptor aldose and has to accommodate numerous non-covalent and covalent substrate-cofactor intermediates. Recent structural findings of trapped reaction intermediates in TK revealed that molecular strain within substrate-cofactor adducts and bound acceptor substrates plays a crucial role for the forward commitment of TK-catalyzed reaction. This enzymatic strategy is presumably generalizable to all enzymes requiring this coenzyme and was therefore analyzed in detail in transketolase. This doctoral thesis presents a comprehensive structural analysis of central intermediates that are transiently formed along the reaction coordinate of human and bacterial (Escherichia coli) TK and correlates structural properties of intermediates with their chemical reactivity. By combining high-resolution x-ray crystallography with kinetic and biophysical methods a detailed picture of the entire TK reaction cycle is illustrated. TK in complex with all native, covalent reaction intermediates could be determined structurally at true atomicity which allowed to unambiguously assign the protonation state and to visualize subtle geometrical distortions of those metastable species. All of these intermediates possess significant angular distortion of the carbon-carbon bonds connecting substrate and coenzyme confirming earlier findings for analogous structures. Angular distortions are also observable for both aromatic ring systems of the cofactor indicating that the entire intermediates are strained and high in energy. TK selectively promotes C-C bond cleavage by pKa adjustment of active site residues and specific elongation of the scissile covalent bonds. Remarkably, this specific bond stretching might drastically accelerate bond cleavage by reducing the bond dissociation energy an unprecedented observation for an enzymatic reaction intermediate. The adaption of TKs active site to bind and stabilize numerous intermediates differing in chain length is accomplished by a conserved pattern of polar interactions for the substrate derived hydroxyl groups and the phosphate moieties. Interestingly, no structural rearrangements of active site residues are observed during substrate conversion indicating that TK active site is already aligned for all steps of catalysis.de
dc.contributor.coRefereeFicner, Ralf Prof. Dr.de
dc.contributor.thirdRefereeGriesinger, Christian Prof. Dr.de
dc.subject.topicBiology (incl. Psychology)de
dc.subject.gerRöntgenkristallographiede
dc.subject.gerTransketolasede
dc.subject.gerThiamindiphosphatde
dc.subject.gerPentosephosphatwegde
dc.subject.gerReaktionsintermediatede
dc.subject.gerMolekülspannungde
dc.subject.engx-ray crystallographyde
dc.subject.engtransketolasede
dc.subject.engthiamine diphosphatede
dc.subject.engpentose-phosphate-pathwayde
dc.subject.engreaction intermediatede
dc.subject.engmolecular strainde
dc.subject.bk42.12de
dc.subject.bk35.13de
dc.subject.bk35.17de
dc.subject.bk35.25de
dc.subject.bk35.70de
dc.subject.bk35.73de
dc.subject.bk35.77de
dc.identifier.urnurn:nbn:de:gbv:7-webdoc-3670-0de
dc.identifier.purlwebdoc-3670de
dc.affiliation.instituteBiologische Fakultätde
dc.description.embargoed2013-05-21de
dc.identifier.ppn750587709


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