Novel interaction partners of the chromatin remodeler CHD7, a protein mutated in CHARGE syndrome

Abstract

Zusammenfassung CHARGE Syndrom, ein autosomal dominant vererbtes Malformationssyndrom wird durch Mutationen im Chromodomänen Helikase DNA bindenden protein 7 (CHD7) Gen hervorgerufen. In 10% der „typischen“ und 40-50% der „atypischen“ CHARGE Patienten findet sich keine Mutation im CHD7 Gen und somit bleibt die Ursache der Symptomatik in diesen Fällen unklar. CHD7 ist ein nukleär lokalisierter chromatin remodeler, der in großen Multiproteinkomplexen detektiert werden konnte und die Expression verschiedener Gene reguliert. Die Charakterisierung von CHD7 Interaktionspartnern ist möglicherweise hilfreich um die Pathogenese des CHARGE Syndroms zu verstehen. Für einige andere genetisch bedingte Erkrankungen konnte gezeigt werden, dass Mutationen in Interaktionspartnern zu demselben oder einem ähnlichen Krankheitsbild führen. Daher vermuten wir, dass CHD7 Interaktionspartner gute Kandidaten sind, die möglicherweise im mutierten Zustand ebenfalls zum CHARGE Syndrom führen. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde CHD8 als ein Interaktionspartner von CHD7 identifiziert. Die Interaktion des CHD7 Teilstückes (Aminosäuren: 1593-2178) mit einem CHD8 Teilstück (Aminosäuren: 1789-2302) wurde mittels verschiedener molekularer Techniken validiert. Zusätzlich konnten wir zeigen, dass die Interaktion im Nuckleoplasma stattfindet. Darüber hinaus wurde der Einfluss von 3 in der Literatur beschriebenen Mutationen (p.His2096Arg, p.Val2102Ile und p.Gly2108Arg) und einer neu identifizierten (p.Trp2091Arg) CHD7 missense Mutation auf die CHD7-CHD8 Interaktion mittels Yeast two hybrid (Y2H) und Co-Immunopräzipitation (Co-IP) untersucht. Während wir mittels Y2H zeigen konnten, dass die CHD7-CHD8 Interaktion durch die CHD7 missense Mutationen p.Trp2091Arg, p.His2096Arg und p.Gly2108Arg aufgehoben wird, konnte dieser Effekt mittels Co-IP nicht nachgewiesen werden. Daher vermuten wir, dass CHD7 und CHD8 einerseits direkt miteinander interagieren (gezeigt durch die direkten Y2H Experimente) und zusätzlich indirekt über sog. Linker Proteine, die zusammen mit CHD7 und CHD8 einen großen Proteinkomplex formen (Erklärung für die Co-IP Ergebnisse). Zusätzlich haben wir CHD7 negative CHARGE Patienten auf Mutationen im CHD8 Gen untersucht. Im zweiten Teil der Doktorarbeit zeigen wir die Ergebnisse der SILAC und Massenspektrometrie Analyse, bei der wir das bisher uncharakterisierte Protein FAM124B als eine Komponente eines CHD7-CHD8 enthaltenden Komplexes identifizierten. Die Interaktion mit dem CHD8 Teilstück (Aminosäuren 1789-2302) wurde mittels direktem Y2H und Co-IPs validiert, während eine Interaktion mit dem CHD7 Teilstück (Aminosäuren 1593-2178) nur mittels Co-IP bestätigt werden konnte, wodurch gezeigt wurde, dass FAM124B nicht direkt mit der o.g. CHD7 Region interagiert. Zusätzlich erfolgte eine Charakterisierung von FAM124B. Wir konnten zeigen, dass FAM124B, wie CHD7 und CHD8 im Zellkern lokalisiert ist. Fam124B wird bei der Maus in den Organen, die beim CHARGE Syndrom betroffen sind expremiert. Eine starke Expression konnte in dem sich entwickelnden Gehirn, Herzen, Lunge und im Rückenmark von E12.5 Mauseembryonen nachgewiesen werden. Kürzlich konnte gezeigt werden, dass Mutationen in CHD8 Autismus (ASD) und Entwicklungsstörungen des Nervensystems (NDD) bewirken können. Zusammenfassend, weisen unsere Daten darauf hin, dass das bisher uncharakterisierte Protein FAM124B eine sehr wichtige Funktion in der Embryonalentwicklung hat und möglicherweise an der Pathogenese des CHARGE Syndroms und ASD/NDD beteiligt ist. Um eine mögliche Rolle von FAM124B an der Pathogenese des CHARGE Syndroms und Neurocristopathien zu analysieren, planen wir die Herrunterregulierung von Fam124B in Xenopus laevis um anschließend den Einfluss von Fam124B auf Gene, die an der Neuralleistenzellformation beteiligt sind zu testen. Die Generierung eines Fam124B knockout Mausmodels und die weitere Charakterisierung von CHD7 Interaktionspartnern werden zur Erlangung tiefgreifender Kenntnisse des molekularen Mechanismus des CHARGE Syndroms und Autismus Erkrankungen hilfreich sein.