A genetic system to study the nuclear pore complex permeability barrier of the yeast Saccharomyces cerevisiae
Ein genetisches System zur Untersuchung der Permeabilitätsbarriere des Kernporenkomplexes der Hefe Saccharomyces cerevisiae
by Michael Ridders
Date of Examination:2012-06-07
Date of issue:2012-11-20
Advisor:Prof. Dr. Dirk Görlich
Referee:Prof. Dr. Dirk Görlich
Referee:Prof. Dr. Gerhard Braus
Referee:Dr. Hans Dieter Schmitt
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Abstract
English
All nucleocytoplasmic transport occurs through nuclear pore complexes (NPCs). To hinder uncontrolled mixing of cytoplasmic and nuclear content, NPCs maintain the permeability barrier that suppresses passage of inert macromolecules but allows facilitated translocation of even very large cargoes provided these are bound to nuclear transport receptors (NTRs). About a third of the proteins that built up the NPC contains so-called FG domains that are essential for establishing the NPC permeability barrier. NTRs bind to FG motifs and this interaction is essential for their privileged passage. How this binding accelerates NPC passage is one of the enigmas in the field. FG domains are quite diverse, di ffering in their cohesiveness, in their FG motifs, their length, their charge distribution, and in the sequence of the spacers between the individual FG motifs. The biophysical and biochemical properties of individual FG domains have been well studied in vitro. The signi cance of most of the observed features for the functionality of the permeability barrier in vivo, however, so far remained unclear. Previously, the in vivo signifi cance of individual FG domains was studied by generating S. cerevisiae deletion strains lacking multiple FG domains in various combinations. We show that previously reported lethal phenotypes of the combined deletion of FG domains were not exclusively caused by the deletions but were a result of the previously applied deletion strategy. Moreover, with an alternative deletion strategy, we show that S. cerevisiae tolerates more FG domain deletions than expected so far. The focus of this thesis has been to elucidate which FG domain features are essential for permeability barrier function in vivo. We established an in vivo system allowing to analyze the functional contribution of individual FG domains by testing the consequences of mutations, deletions, or exchange of these domains for cell viability. Employing this in vivo system, we find that the very cohesive FG domains of Nup100p and Nup116p play a prominent role in maintaining the permeability barrier. We show that not all FG domains can functionally replace these prominent FG domains, suggesting that NTR binding alone is not su cient to explain the functionality of the permeability barrier. Additionally, we show that the anchor points for FG domains within the NPC are not equivalent. Our findings support models of permeability barrier functionality that rely on the cohesiveness of FG domains. Based on our results, we, however, assume that both the excessive presence of cohesive FG mass as well as the absence of very cohesive FG domains is incompatible with viability.
Keywords: Nuclear Pore Complex; FG Domain; yeast; Nucleocytoplasmic transport; permeability barrier; hydrogel; selective phase model
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Kernporenkomplexe (NPCs) verbinden das
Zytoplasma mit dem Nukleoplasma. Ein unkontrollierter Austausch von
Molekülen zwischen diesen Kompartimenten wird durch die
Permeabilitätsbarriere der Kernporenkomplexe verhindert. Diese
supprimiert einerseits die Passage von inerten Makromoleküle,
andererseits aber fördert sie den Transport von Molekülen soweit
diese im Komplex mit Kern-Transport-Rezeptoren (NTRs)
vorliegen.
Ungefähr ein Drittel der Proteine, die den NPC bilden, enthalten so
genannte FG Domänen. Diese FG Domänen bilden die
Permeabilitätsbarriere. NTRs binden an einzelne FG Motive dieser
Domänen und diese Interaktion ist essentiell für die Passage von
NTR-Molekül-Komplexen durch den NPC. Auf welche Art und Weise diese
Interaktion den beschleunigten Transport von NTR-Molekül-Komplexen
durch den NPC ermöglicht, ist jedoch rätselhaft.
FG Domänen sind sehr verschiedenartig. Sie unterscheiden sich in
ihrer Kohäsionskraft, in ihren FG Motiven, ihrer Länge, der
Ladungsverteilung sowie der Sequenz zwischen einzelnen FG Motiven.
Die biophysikalischen und biochemischen Eigenschaften einzelner FG
Domänen wurden gut in vitro analysiert. Dennoch ist die in vivo
Bedeutung der Eigenschaften einzelner FG Domänen für die
Funktionalität der Permeabilitätsbarriere nach wie vor
ungeklärt.
Bisher wurde versucht Fragen nach der in vivo Bedeutung einzelner
FG Domänen zu beantworten, indem mehrere FG Domänen in
verschiedenen Kombinationen gleichzeitig in S. cerevisiae deletiert
und daraus resultierende Phänotypen analysiert wurden.
Wir konnten zeigen, dass bisher berichtete letale Phänotypen in
mehrfach FG deletierten Stämmen nicht ausschließlich durch den
Mangel an FG Domänen verursacht werden, sondern sich vor allem
aufgrund der angewandten Deletionsstrategie ausprägen.
Mit einer alternativen Deletionsstrategie können wir nun vielmehr
zeigen, dass S. cerevisiae mehr Deletionen von FG Domänen toleriert
als vormals angenommen.
Der Schwerpunkt dieser Arbeit lag darin zu eruieren welche
Eigenschaften von FG Domänen für die in vivo Funktionalität der
Permeabilitätsbarriere essentiell sind. Dafür haben wir ein in vivo
System etabliert, dass es uns erlaubt die Funktionalität einzelner
FG Domänen zu untersuchen, in dem wir die Auswirkungen von
Mutationen, Deletionen oder eines Domänenaustausches auf die
Lebensfähigkeit von S. cerevisiae analysieren.
Mit diesem System können wir zeigen, dass die besonders kohäsiven
FG Domänen von Nup100p und Nup116p eine besondere Rolle im Erhalt
der Permeabilitätsbarriere spielen und dass sie funktionell nicht
durch beliebige FG Domänen ersetzt werden können. Diese Tatsache
deutet darauf hin, dass die Fähigkeit zur Bindung von NTRs alleine
nicht ausreichend ist um die Funktionsweise der
Permeabilitätsbarriere zu erklären. Darüber hinaus legen wir dar,
dass die einzelnen Ankerpunkte der FG Domänen in der Kernpore nicht
gleichwertig sind.
Unsere Ergebnisse stützen jene Modelle, die zur Erklärung der
Funktionalität der Permeabilitätsbarriere die kohäsiven
Eigenschaften von FG Domänen heranziehen. Allerdings nehmen wir auf
Grund unserer Ergebnisse an, dass sowohl eine exzessive Präsenz von
kohäsiver FG Masse als auch deren Abwesenheit zum Zelltod
führt.
Schlagwörter: Kernporenkomplex; FG-Domäne; Hefe; Nucleocytoplasmatischer Transport; Permeabilitätsbarriere; Hydrogel; Selektive Phase