Analysis of CRM1- and Nup214- dependent nuclear export of proteins
Analyse des CRM1- und Nup214- abhängigen Kernexportes von Proteinen
by Stephanie Roloff
Date of Examination:2012-05-21
Date of issue:2012-12-12
Advisor:Prof. Dr. Ralph Kehlenbach
Referee:Prof. Dr. Ralph Kehlenbach
Referee:Prof. Dr. Peter Rehling
Referee:Prof. Dr. Ralf Ficner
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Abstract
English
Nuclear pore complexes (NPCs) are giant units of the nuclear envelope, mediating directional transport into and out of the nucleus. Nucleoporins are the main components of the NPC, and one third of them contain phenylalanine-glycine (FG) repeats. They are believed to serve as binding sites for transport receptors of the karyopherin familiy. CRM1 is the main export receptor in eucaryotic cells. It has a ring-like structure that is composed of HEAT (Huntingtin Elongation Factor A Subunit TOR) repeats (HRs) and exports various cargo proteins containing a leucine-rich nuclear export signal (NES). In the nucleus, the export complex assembles together with the small GTPase Ran in its GTP-bound state. On its way through the nuclear pore, the trimeric export complex interacts with several nucleoporins, among them Nup214. Nup214 is loacated at the cytoplasmic side of the NPC and its FG-rich C-terminus interacts with CRM1 in a RanGTP-dependent manner, providing a terminal docking site for CRM1-RanGTP-cargo complexes in the late steps of nuclear export. This interaction also indicates a specific role for Nup214 in nuclear export, at least for some cargos. Whereas the CRM1-binding region in Nup214 is known, the CRM1-binding sites for Nup214 have not been identified so far. In this work, we analyzed the localization and the export potential of CRM1-fragments, mutants and chimeras, derived from H.sapiens and C.elegans CRM1. Whereas CRM1-fragments did not associate with the nuclear envelope and were not able to mediate export in mammalian cells, we found one CRM1-chimera which was located at the nuclear envelope and was able to transport NES-cargos through the nuclear pore. From that we conclude that association of CRM1 with the nuclear pore correlates with the ability to promote nuclear export. By comparing several chimeras with respect to their localization and functionality, we hypothesize that Nup214 binding occurs between HRs 9-11 of CRM1. Transport receptors bind preferentially to FGs in nucleoporins. For CRM1 this had not been analyzed in detail. Here we show that CRM1 specifically binds to the FGs in Nup214. Moreover, we could narrow down the Nup214 region for CRM1-binding. By analyzing short Nup214-fragments and mutants, we identified a prominent FG-motif in Nup214, comprising 20 amino acid residues. This motif interacts with CRM1 in a RanGTP-dependent manner, with enhanced binding in the presence of an NES-cargo. Two other Nup214 regions downstream of this motif contribute to the stability of this interaction.
Keywords: nuclear pore complex; export receptor; CRM1; nucleoporin; Nup214; FG-repeats
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Kernporenkomplexe sind sehr große
Einheiten der Zellkernhülle, die den direktionalen Transport von
Substraten in und aus dem Zellkern vermitteln. Besondere Proteine,
Nukleoporine (Nups), stellen die Hauptkomponente dieses Komplexes
dar. Ungefähr ein Drittel von ihnen enthält
Phenylalanin-Glycin-Wiederholungen (FG-repeats), die als
Bindestellen für Transport-rezeptoren der Karyopherinfamilie
dienen. CRM1 (Chromosome Region Maintenance 1) als
Hauptexportrezeptor in eukaryotischen Zellen besteht aus 21 HEAT
(Huntingtin Elongation Factor A Subunit TOR)-repeat Motiven, die in
einer ringähnlichen Struktur angeordnet sind. CRM1 exportiert
Proteine mit einer Leucin-reichen Exportsequenz vom Zellkern in das
Zytoplasma. Die Assemblierung des CRM1-Substrat-Komplexes im
Zellkern benötigt die kleine GTPase Ran (RAs related Nuclear
protein) im GTP-gebundenen Zustand. Dieser trimere Exportkomplex
verlässt den Zellkern und wandert durch die Kernpore. Auf diesem
Weg interagiert CRM1 mit verschiedenen Nups. Nup214, eines dieser
Nups, befindet sich auf der zytoplasmatischen Seite der Kernpore.
Es interagiert über seine C-terminale FG-reiche Region mit CRM1 in
einer RanGTP-abhängigen Weise und stellt so eine terminale
Bindestelle für Exportkomplexe dar. Welche Region(en) in CRM1 die
Interaktion mit Nup214 vermittelt, ist bisher nicht bekannt und
wurde in dieser Arbeit untersucht. Dafür haben wir die Lokalisation
und das Exportpotential von CRM1-Fragmenten und -Mutanten und
CRM1-Chimären aus H. sapiens und C. elegans analysiert.
Grundsätzlich waren CRM1-Fragmente nicht mit der Kernhülle
assoziiert und auch nicht in der Lage, Exportsubstrate in das
Zytoplasma zu transportieren. Unter den getesteten CRM1-Chimären
fanden wir eine, die sowohl mit der Kernhülle assoziierte als auch
einige Substrate exportieren konnte. Daraus schließen wir, dass
CRM1 die Assoziation mit der Kernhülle (= Interaktion mit Nups)
benötigt, um Substrate aus dem Zellkern exportieren zu können.
Durch Vergleiche der Chimären in Hinblick auf Funktionalität und
Lokalisation nehmen wir an, dass sich die Binderegion für Nup214 in
den HEAT-repeats 9-11 von CRM1 befindet. Darüber hinaus konnten wir
die Binderegion in Nup214 für CRM1 einengen. Bisher war bekannt,
dass einige Transportrezeptoren mit den FGs von Nups interagieren.
Für CRM1 wurde eine derartige Bindung an Nup214 bisher nur
angenommen. Hier zeigen wir, dass es tatsächlich die FGs in Nup214
sind, die mit CRM1 interagieren. Durch in vivo- und in
vitro-Studien mit Nup214-Fragmenten aus dem FG-reichen C-terminalen
Bereich fanden wir ein auffälliges FG-Motiv, bestehend aus 20
Aminosäuren. Dieser Bereich interagierte RanGTP- und
Exportsubstrat-abhängig mit CRM1. Stabilisiert wurde diese Bindung
wurde durch zwei weitere Regionen im C-terminalen Bereich von
Nup214.
Schlagwörter: Kernporenkomplex; Exportrezeptor; CRM1; Nukleoporin; Nup214; FG-repeats