Analysis of CRM1- and Nup214- dependent nuclear export of proteins

Abstract

Kernporenkomplexe sind sehr große Einheiten der Zellkernhülle, die den direktionalen Transport von Substraten in und aus dem Zellkern vermitteln. Besondere Proteine, Nukleoporine (Nups), stellen die Hauptkomponente dieses Komplexes dar. Ungefähr ein Drittel von ihnen enthält Phenylalanin-Glycin-Wiederholungen (FG-repeats), die als Bindestellen für Transport-rezeptoren der Karyopherinfamilie dienen. CRM1 (Chromosome Region Maintenance 1) als Hauptexportrezeptor in eukaryotischen Zellen besteht aus 21 HEAT (Huntingtin Elongation Factor A Subunit TOR)-repeat Motiven, die in einer ringähnlichen Struktur angeordnet sind. CRM1 exportiert Proteine mit einer Leucin-reichen Exportsequenz vom Zellkern in das Zytoplasma. Die Assemblierung des CRM1-Substrat-Komplexes im Zellkern benötigt die kleine GTPase Ran (RAs related Nuclear protein) im GTP-gebundenen Zustand. Dieser trimere Exportkomplex verlässt den Zellkern und wandert durch die Kernpore. Auf diesem Weg interagiert CRM1 mit verschiedenen Nups. Nup214, eines dieser Nups, befindet sich auf der zytoplasmatischen Seite der Kernpore. Es interagiert über seine C-terminale FG-reiche Region mit CRM1 in einer RanGTP-abhängigen Weise und stellt so eine terminale Bindestelle für Exportkomplexe dar. Welche Region(en) in CRM1 die Interaktion mit Nup214 vermittelt, ist bisher nicht bekannt und wurde in dieser Arbeit untersucht. Dafür haben wir die Lokalisation und das Exportpotential von CRM1-Fragmenten und -Mutanten und CRM1-Chimären aus H. sapiens und C. elegans analysiert. Grundsätzlich waren CRM1-Fragmente nicht mit der Kernhülle assoziiert und auch nicht in der Lage, Exportsubstrate in das Zytoplasma zu transportieren. Unter den getesteten CRM1-Chimären fanden wir eine, die sowohl mit der Kernhülle assoziierte als auch einige Substrate exportieren konnte. Daraus schließen wir, dass CRM1 die Assoziation mit der Kernhülle (= Interaktion mit Nups) benötigt, um Substrate aus dem Zellkern exportieren zu können. Durch Vergleiche der Chimären in Hinblick auf Funktionalität und Lokalisation nehmen wir an, dass sich die Binderegion für Nup214 in den HEAT-repeats 9-11 von CRM1 befindet. Darüber hinaus konnten wir die Binderegion in Nup214 für CRM1 einengen. Bisher war bekannt, dass einige Transportrezeptoren mit den FGs von Nups interagieren. Für CRM1 wurde eine derartige Bindung an Nup214 bisher nur angenommen. Hier zeigen wir, dass es tatsächlich die FGs in Nup214 sind, die mit CRM1 interagieren. Durch in vivo- und in vitro-Studien mit Nup214-Fragmenten aus dem FG-reichen C-terminalen Bereich fanden wir ein auffälliges FG-Motiv, bestehend aus 20 Aminosäuren. Dieser Bereich interagierte RanGTP- und Exportsubstrat-abhängig mit CRM1. Stabilisiert wurde diese Bindung wurde durch zwei weitere Regionen im C-terminalen Bereich von Nup214.