Innovative NIR fluorescent probes for an improved tumor detection in vivo

Abstract

Es besteht großer Bedarf an der Entwicklung hochfluoreszenter und spezifischer Sonden, die eine sensitive und frühzeitige Detektion von Krebserkrankungen in vivo sowie die Unterscheidung von Tumor- und gesundem Gewebe mittels nicht-invasiver bildgebender Verfahren ermöglichen. Hierbei stellt die Autofluoreszenz einen maßgeblichen Schwachpunkt der in vivo Fluoreszenzbildgebung dar, da sie die Detektion der Sondensignale erschwert. In der hier vorliegenden Studie wurden zwei neue Fluoreszenzsonden hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Tumordarstellung untersucht: ein pH-sensitiver Farbstoff konjugiert mit dem tumorspezifischen Antikörper Herceptin (pH-Her) sowie mit dem Breitbandfluorophor Itrybe beladene Polystyren Nanopartikel (NPs) unterschiedlicher Größen (15, 25 und 100 nm) und verschiedener Oberflächenmodifikationen (NH2, Polyethylenglycol [PEG] und Herceptin). Die Untersuchungen mittels zeitaufgelöster Nahinfrarot (NIR) Fluoreszenzbildgebung wurden in Nacktmäusen mit orthotopen HER2-positiven (KPL-4) und HER2-negativen (MDA-MB-231) Brusttumor-Xenografts durchgeführt. Die pH-Sensitivität und Funktionalität von pH-Her wurde anhand von spektroskopischen Untersuchungen und in zellbasierten Assays bestätigt. In Mäusen mit HER2-positiven Tumoren führte die Gabe von pH-Her, dessen Fluoreszenz lediglich in der aziden Umgebung des Tumors aktiviert wird, zu einem Anstieg des Signal-Rausch-Verhältnisses (CNR) nach Subtraktion der Autofluoreszenz. Daraus ergab sich eine erhöhte Sensitivtät der Tumordetektion im Vergleich zu dem stetig fluoreszenten Kontrollkonjugat Alexa Fluor 647-Herceptin (Alexa-Her). Im Gegensatz dazu führten lebensdauerbasierte Fluoreszenzmessungen in Kombination mit pH-Her und Alexa-Her zu keiner Verbesserung der Tumordetektion in vivo. Die breiten Anregungs- und Emissionsspektren von Itrybe in NPs ermöglichen die Anregung und die sensitive Detektion dieses Farbstoffs in vivo bei unterschiedlichen Wellenlängen im NIR-Bereich. Des Weiteren konnte in Immunassays sowie in Experiment en an KPL-4 Tumorzellen und –schnitten eine spezifische Bindung von Herceptin-konjugierten 100 nm NPs an HER2 gezeigt werden. Dennoch ließ sich zu einem gewissen Grad auch eine unspezifische Bindung/Aufnahme in die Zellen beobachten. Nach in vivo Injektion akkumulierten PEGylierte NPs aller Größen in MDA-MB-231, jedoch nicht in KPL-4 Tumoren, wie in ex vivo Messungen der Tumore gezeigt werden konnte. Biodistributionsanalysen in gesunden Nacktmäusen zeigten eine schnelle Aufnahme der NPs aller Größen in die Leber, was mit einer raschen Elimination der NPs aus dem Blut einherging. Dies wiederum verhinderte die effiziente Akkumulation der Sonde im Tumor. Zusammenfassend stellt der pH-sensitive Farbstoff CypHer5E in Kombination mit tumor-spezifischen Liganden eine sehr gute Sonde für das sensitive in vivo Monitoring von Tumoren dar und könnte somit auch zur Detektion schwacher Signale von beispielsweise Metastasen eingesetzt werden. Die hochfluoreszenten, mit Itrybe beladenen NPs haben ein großes Potential für unterschiedlichste Bildgebungsapplikationen. Sie bieten eine 3D- Plattform für vielfache Modifikationen und können deshalb dazu genutzt werden, verschiedene biologische Fragestellungen in vivo zu adressieren. Dennoch muss die Bioverfügbarkeit der mit Itrybe beladenen NPs, beispielsweise durch Modifikationen ihrer Oberflächen oder ihrer Zusammensetzung, weiter verbessert werden, um eine effizientere Anreicherung der NPs im Tumor in vivo zu gewährleisten.