Klonierung und Expression einer extrazellulären Lipase von A. fumigatus

Abstract

Jährlich erkrankt in Deutschland eine Vielzahl von Menschen an einer durch Aspergillus fumigatus ausgelösten invasiven Schimmelpilzmykose. Fast ausschließlich betroffen sind schwer immunsupprimierte Patienten. Die Infektion mit A. fumigatus findet in der Regel über die Aufnahme von Sporen in die Lunge statt. Während beim Menschen die angeborene Immunität die entscheidende Rolle in der Abwehr des Pilzes spielt, stellt sich in Mäusen nach überlebter invasiver Aspergillose eine erworbene Immunität ein. In verschiedenen Studien konnte mit Einzelantigenen von A. fumigatus im Tiermodell bereits eine Immunität induziert werden. Mittels dieser Einzelantigene sowie der Identifizierung weiterer Immunität induzierender Antigene könnte die Basis für die spätere Entwicklung eines Impfstoffs gegenüber dieser Erkrankung geschaffen werden. Eine wichtige Gruppe erfolgversprechender Impfantigene sind Lipasen. So wurden für andere Organismen Lipasen als Virulenz- und Immunitäts-vermittelnd klassifiziert. In dieser Arbeit gelang es durch Sondenscreening einer Lambda-Phagen-cDNA-Bank die für eine Lipase von A. fumigatus kodierende cDNA zu extrahieren. Diese wurde anschließend gereinigt, mit Restriktionsenzymen behandelt und in einen Plasmid kloniert. Es erfolgte der Transfer in einen bakteriellen Expressionsstamm. Nach ihrer Expression wurde diese Lipase affinitätschromatographisch gereinigt. Die Sequenzanalyse erbrachte ein hypothetisches Signalpeptid und eine Vielzahl konservierter Domänen. So konnten das katalytische Zentrum, der Deckel (lid) sowie das nukleophile Zentrum identifiziert werden. Diese konservierten Domänen verweisen u.a. auf die Zugehörigkeit des klonierten Enzyms zu Lipasen, die nach EC-Klassifikation in die Gruppe 3.1.1.3 eingeteilt werden. Die vorliegende Arbeit soll als Grundlage dienen, im Hinblick auf die Entwicklung eines Impfstoffs gegenüber A. fumigatus die extrazelluläre Lipase im Tiermodell auf Induktion einer protektiven Immunität zu untersuchen. Ebenso soll sie dazu beitragen Lipase-knockout-Mutanten herzustellen. Diese sollten mit dem Wildtyp verglichen werden, um auf eine mögliche Rolle der Lipase während der Pathogenese rückschließen zu können.