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Klonierung und Expression einer extrazellulären Lipase von A. fumigatus

Cloning and expression of an extracellular lipase from A. fumigatus

by Christoph Paasch
Doctoral thesis
Date of Examination:2012-05-21
Date of issue:2012-05-15
Advisor:Prof. Dr. Holger Reichardt
Referee:Prof. Dr. Holger Reichardt
Referee:Prof. Dr. Dieter Kube
Referee:Prof. Dr. Detlef Doenecke
crossref-logoPersistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-1521

 

 

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Format:PDF
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Abstract

English

In Germany every year a great number of people contract invasive mould mycosis initiated by the fungus Aspergillus fumigatus. Almost solely severe immunocompromised patients are being affected. The infection with A. fumigatus commonly takes place by absorbing spores into the lung. While humen gain immune defense against the fungus due to innate immunity, mice develop acquired immunity by surviving an invasive aspergillosis. Several studies using an animal model showed that immunity can be induced by using single antigens of A. fumigatus. The use of these single antigens as well as the identification of more immunity inducing antigens could form the basis for developing a vaccine against the desease. A promising group of vaccine antigens are lipases. In other organisms lipases were classified as being virulence and immunity mediating. The work at hand shows the successful extraction of a for a lipase encoding cDNA of A.fumigatus by screening a Lambda-Phage-cDNA library with an hybridization probe. In addition this cDNA was being purified, treated with restriction enzymes and cloned in a plasmid. Then it was being transfered into a bacterial expression strain. After the expression the lipase was being purified by affinity chromatography. The analysis of the sequence supplied an hypothetical signal peptide and numerous conserved domains. That way it was possible to identify the catalytic center, the lid as well as the nucleophilic center. These conserved domains show - amongst other things – that the cloned enzyme belongs to lipases, which according to the EC-classification belong to the group 3.1.1.3. The work at hand shall serve as a basis for the development of a vaccine against A. fumigatus using an animal model helping to detect an extracellular lipase induced protective immunity. It shall contribute to the cultivation of lipase-knockout-mutants. These mutants shall be compared to their wild type to conclude that they may play a significant role in the pathogenesis.
Keywords: extracellular lipase; Aspergillus fumigatus; vaccine; mould mycosis

Other Languages

Jährlich erkrankt in Deutschland eine Vielzahl von Menschen an einer durch Aspergillus fumigatus ausgelösten invasiven Schimmelpilzmykose. Fast ausschließlich betroffen sind schwer immunsupprimierte Patienten. Die Infektion mit A. fumigatus findet in der Regel über die Aufnahme von Sporen in die Lunge statt. Während beim Menschen die angeborene Immunität die entscheidende Rolle in der Abwehr des Pilzes spielt, stellt sich in Mäusen nach überlebter invasiver Aspergillose eine erworbene Immunität ein. In verschiedenen Studien konnte mit Einzelantigenen von A. fumigatus im Tiermodell bereits eine Immunität induziert werden. Mittels dieser Einzelantigene sowie der Identifizierung weiterer Immunität induzierender Antigene könnte die Basis für die spätere Entwicklung eines Impfstoffs gegenüber dieser Erkrankung geschaffen werden. Eine wichtige Gruppe erfolgversprechender Impfantigene sind Lipasen. So wurden für andere Organismen Lipasen als Virulenz- und Immunitäts-vermittelnd klassifiziert. In dieser Arbeit gelang es durch Sondenscreening einer Lambda-Phagen-cDNA-Bank die für eine Lipase von A. fumigatus kodierende cDNA zu extrahieren. Diese wurde anschließend gereinigt, mit Restriktionsenzymen behandelt und in einen Plasmid kloniert. Es erfolgte der Transfer in einen bakteriellen Expressionsstamm. Nach ihrer Expression wurde diese Lipase affinitätschromatographisch gereinigt. Die Sequenzanalyse erbrachte ein hypothetisches Signalpeptid und eine Vielzahl konservierter Domänen. So konnten das katalytische Zentrum, der Deckel (lid) sowie das nukleophile Zentrum identifiziert werden. Diese konservierten Domänen verweisen u.a. auf die Zugehörigkeit des klonierten Enzyms zu Lipasen, die nach EC-Klassifikation in die Gruppe 3.1.1.3 eingeteilt werden. Die vorliegende Arbeit soll als Grundlage dienen, im Hinblick auf die Entwicklung eines Impfstoffs gegenüber A. fumigatus die extrazelluläre Lipase im Tiermodell auf Induktion einer protektiven Immunität zu untersuchen. Ebenso soll sie dazu beitragen Lipase-knockout-Mutanten herzustellen. Diese sollten mit dem Wildtyp verglichen werden, um auf eine mögliche Rolle der Lipase während der Pathogenese rückschließen zu können.
Schlagwörter: extrazelluläre Lipase; Aspergillus fumigatus; Mykosen; Impfantigene
 

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