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siRNA-basierte Studien zu der physiologischen Funktion des Transkriptionsfaktors Runx2 in humanen Osteoblasten

siRNA-based studies regarding physiological function of transcription factor Runx2 in human osteoblasts

by Kai-Henrik Peiffer
Doctoral thesis
Date of Examination:2012-05-09
Date of issue:2012-05-29
Advisor:Prof. Dr. Heide Siggelkow
Referee:Prof. Dr. Heide Siggelkow
Referee:Prof. Dr. Heidi Hahn
crossref-logoPersistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-1531

 

 

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Abstract

English

Physiological osteoblast differentiation is a very complex process. The osteoblast specific transcription factor runx2 with its multiple regulatory mechanisms is essential for proper osteoblast differentiation. Our knowledge of these mechanisms is mainly based on studies in murine models. Therefore we asked if these mechanisms remain valid also in mammalian cells. We performed siRNA based runx2 knock down studies in primary human cells, derived from bone, which is an established model for osteoblast differentiation. For a transient and a stable knock down a siRNA expressing plasmid was cloned, which expresses shRNA molecules (precursors of siRNAs) in the transfected cell. Furthermore a transient 4-day runx2 knock down was induced by transfection of exogenous synthesized siRNA and was analyzed with RNA-microarray technique. With a 90 percent transfection rate nucleofection was established as a potent method for transfection of our siRNA expressing plasmid in pHOB cells. Although microarray analysis shows a high shRNA expression, no runx2 suppression was induced. We hypothesize that low or deficient enzymatic activity in shRNA processing (Drosha, Pasha) or intracellular transport (Exportin 5) is responsible for the inability of our siRNA expressing plasmid to induce a runx2 knock down in pHOB cells. A lot of interesting insights about the regulatory function of runx2 in pHOB cells were gained by the transient runx2 knock down, induced by transfection of exogenous synthezised siRNA. The known regulatory function of runx2 in the expression of typical osteolastic genes osteocalcin, osteopontin and most probably collagen type 1 and bone sialoprotein was confirmed by our studies. Furthermore we noticed an unknown connection of runx2 to β-catenin, the key molecule of canonical Wnt pathway, which is another essential transcription factor for osteoblast differentiation. As a result of our findings there could be a direct induction of β-catenin by runx2. Also the expression of other members of the canonical Wnt pathway (frizzled-related protein-1, frizzled homolog 6, WNT inhibitory factor 1) were influenced significantly by the runx2 knock down. The knock down also showed a regulatory function of runx2 for the expression of 11β-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 (HSD11B1). Because of this runx2 seems to be involved in hormonal pathways by partially regulating the concentration of active cortisol in osteoblasts.
Keywords: runx2; knock down; osteoblasts; Osteoblast differentiation; siRNA; shRNA; β-catenin; osterix; HSD11B1; p-Silencer

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Die physiologische Osteoblastendifferenzierung ist ein hoch komplexer Prozess, in dem der Transkriptionsfaktor Runx2 essentiell ist und über multiple Mechanismen seine Wirkung entfaltet. Da die meisten Erkenntnisse über die physiologische Funktion von Runx2 in murinen Zellmodellen erlangt worden sind, haben wir uns mit der Frage beschäftigt, ob die bisher gefundenen Gesetzmäßigkeiten auch im humanen Modell Gültigkeit besitzen. Hierfür wurden siRNA-basierte Runx2 knock-down Studien in primären Zellen (pHOB) aus dem menschlichen Knochen durchgeführt, welche in osteogenen Kulturbedingungen als ein Modell für die Osteoblastendifferenzierung etabliert worden waren. Für einen transienten und auch stabilen Runx2 knock-down wurde ein siRNA-Expressionsplasmid kloniert, welches ein Vorläufermolekül (shRNA) der gewünschten Runx2-siRNA in der transfizierten Zielzelle exprimiert und so die RNA-Interferenz induziert. Zusätzlich wurde ein transienter knock-down in pHOB Zellen über 4 Tage mit konventioneller, exogen synthetisierter siRNA induziert und mit einem RNA-Microarray analysiert. Für die Transfektion des siRNA-Expressionsplasmids in pHOB wurde mit einer ca. 90-prozentigen Transfektionsrate die Nukleofektion als potente Transfektionsmethode etabliert. In einer RNA-Microarray Analyse zeigte sich eine hohe shRNA-Syntheserate durch das siRNA-Expressionsplasmid in pHOB-Zellen, was allerdings nicht in einer Suppression des Zielgens Runx2 resultierte. Ungenügende oder fehlerhafte enzymatische Reaktionen in der Zielzelle für die shRNA-Prozessierung (Drosha, Pasha) bzw. den intrazellulären Transport (Exportin5) scheinen dafür verantwortlich zu sein, dass das siRNA-Expressionsplasmid in pHOB-Zellen keine Gensuppression von Runx2 erreicht. Durch den mit konventioneller, exogen synthetisierter siRNA vermittelten knock-down von Runx2 wurden viele Erkenntnisse über die Funktion von Runx2 in pHOB erlangt. Die regulative Tätigkeit von Runx2 auf die osteoblastentypischen Gene Osteocalcin, Osteopontin und sehr wahrscheinlich Kollagen Typ 1 und Bone Sialoprotein in pHOB wurden abermals bestätigt. Es zeigte sich weiterhin eine bisher nicht beschriebene Beziehung von Runx2 zu dem Schlüsselmolekül des canonical Wnt-Signalweges β-Catenin. Nach unseren Ergebnissen könnte Runx2 eine direkt induzierende Wirkung auf β-Catenin haben, welches wiederum selbst als Effektorprotein des canonicals Wnt-Signalweges für die Osteoblastendifferenzierung regulative Funktion besitzt. Zudem konnten andere Faktoren des canonicals Wnt-Signalweges wie das secreted frizzled-related protein-1, das frizzled homolog 6 und der WNT inhibitory factor 1 als potentielle Regulatorproteine dieser hochkomplexen Regulationsvorgänge identifiziert werden. Der knock-down zeigte weiterhin eine bisher nicht beschriebene regulative Tätigkeit von Runx2 auf die Expression der 11β-Hydroxisteroid-Dehydrogenase-1 (HSD11B1). Hiermit scheint Runx2 beeinflussend in der Steuerung hormoneller Regelkreisläufe zu agieren, indem es die Menge von in Osteoblasten synthetisierten aktiven Kortisol zumindest zum Teil reguliert.
Schlagwörter: Runx2; knock-down; Osteoblasten; Osteoblastendifferenzierung; siRNA; shRNA; β-Catenin; Osterix; HSD11B1; p-Silencer
 

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