siRNA-basierte Studien zu der physiologischen Funktion des Transkriptionsfaktors Runx2 in humanen Osteoblasten

Abstract

Die physiologische Osteoblastendifferenzierung ist ein hoch komplexer Prozess, in dem der Transkriptionsfaktor Runx2 essentiell ist und über multiple Mechanismen seine Wirkung entfaltet. Da die meisten Erkenntnisse über die physiologische Funktion von Runx2 in murinen Zellmodellen erlangt worden sind, haben wir uns mit der Frage beschäftigt, ob die bisher gefundenen Gesetzmäßigkeiten auch im humanen Modell Gültigkeit besitzen. Hierfür wurden siRNA-basierte Runx2 knock-down Studien in primären Zellen (pHOB) aus dem menschlichen Knochen durchgeführt, welche in osteogenen Kulturbedingungen als ein Modell für die Osteoblastendifferenzierung etabliert worden waren. Für einen transienten und auch stabilen Runx2 knock-down wurde ein siRNA-Expressionsplasmid kloniert, welches ein Vorläufermolekül (shRNA) der gewünschten Runx2-siRNA in der transfizierten Zielzelle exprimiert und so die RNA-Interferenz induziert. Zusätzlich wurde ein transienter knock-down in pHOB Zellen über 4 Tage mit konventioneller, exogen synthetisierter siRNA induziert und mit einem RNA-Microarray analysiert. Für die Transfektion des siRNA-Expressionsplasmids in pHOB wurde mit einer ca. 90-prozentigen Transfektionsrate die Nukleofektion als potente Transfektionsmethode etabliert. In einer RNA-Microarray Analyse zeigte sich eine hohe shRNA-Syntheserate durch das siRNA-Expressionsplasmid in pHOB-Zellen, was allerdings nicht in einer Suppression des Zielgens Runx2 resultierte. Ungenügende oder fehlerhafte enzymatische Reaktionen in der Zielzelle für die shRNA-Prozessierung (Drosha, Pasha) bzw. den intrazellulären Transport (Exportin5) scheinen dafür verantwortlich zu sein, dass das siRNA-Expressionsplasmid in pHOB-Zellen keine Gensuppression von Runx2 erreicht. Durch den mit konventioneller, exogen synthetisierter siRNA vermittelten knock-down von Runx2 wurden viele Erkenntnisse über die Funktion von Runx2 in pHOB erlangt. Die regulative Tätigkeit von Runx2 auf die osteoblastentypischen Gene Osteocalcin, Osteopontin und sehr wahrscheinlich Kollagen Typ 1 und Bone Sialoprotein in pHOB wurden abermals bestätigt. Es zeigte sich weiterhin eine bisher nicht beschriebene Beziehung von Runx2 zu dem Schlüsselmolekül des canonical Wnt-Signalweges β-Catenin. Nach unseren Ergebnissen könnte Runx2 eine direkt induzierende Wirkung auf β-Catenin haben, welches wiederum selbst als Effektorprotein des canonicals Wnt-Signalweges für die Osteoblastendifferenzierung regulative Funktion besitzt. Zudem konnten andere Faktoren des canonicals Wnt-Signalweges wie das secreted frizzled-related protein-1, das frizzled homolog 6 und der WNT inhibitory factor 1 als potentielle Regulatorproteine dieser hochkomplexen Regulationsvorgänge identifiziert werden. Der knock-down zeigte weiterhin eine bisher nicht beschriebene regulative Tätigkeit von Runx2 auf die Expression der 11β-Hydroxisteroid-Dehydrogenase-1 (HSD11B1). Hiermit scheint Runx2 beeinflussend in der Steuerung hormoneller Regelkreisläufe zu agieren, indem es die Menge von in Osteoblasten synthetisierten aktiven Kortisol zumindest zum Teil reguliert.