Untersuchung des Effekts einer Überexpression von Cathepsin B in Zielzellen zytotoxischer Zellen

Abstract

Zytotoxische T Zellen können maligne Tumorzellen durch Freisetzung von Perforin und Granzymen aus präformierten zytotoxischen Granula lysieren. Im Rahmen der zytotoxischen Reaktion sind sowohl die Zielzellen als auch die Killerzellen den Zelltod-Mediatoren ausgesetzt, die Killerzellen überleben diesen Kontakt allerdings. Ihre Unempfindlichkeit wird auf eine lokale membrangebundene Expression der sonst lysosomalen Protease Cathepsin B am Ort der immunologischen Synapse zurückgeführt, wobei Cathepsin B die Killerzellen wahrscheinlich durch Spaltung von Perforin vor der Autolyse schützt. Auch Tumorzellen exprimieren Cathepsin B in membrangebundener Form. Eine Reduktion ihrer zellmembranassoziierten Cathepsin-B-Aktivität erhöht dabei die Empfindlichkeit von Tumorzellen gegenüber Granula-assoziierter Zytotoxizität. Diese Arbeit zeigt, dass die Überexpression von Cathepsin B allein jedoch noch keinen Immune-Escape-Mechanismus für Tumorzellen darstellt. Dazu wird die Cathepsin-B-Expression von RMA-Lymphomzellen durch Transfektion mit zwei unterschiedlichen Expressionskonstrukten gesteigert und der Einfluss dieser den Tumorzellen nachempfundenen Überexpression von Cathepsin B auf die Lyse durch zytotoxische T-Zellen im Chrom-Freisetzungs-Test analysiert. Zur Untersuchung des zytoprotektiven Effekts einer Überexpression lysosomaler Cathepsin B-Formen werden die Zellen mit einem Fusionsprotein aus Cathepsin B und eGFP unter Kontrolle eines CAG-Promotors transfiziert. Der Einfluss von membrangebundenem Cathepsin B auf die Lyse durch zytotoxische T Zellen wird an Zelllinien analysiert, die ein Fusionsprotein bestehend aus der einkettigen aktiven Form von Cathepsin B und der Transmembrandomäne von H2K exprimieren. Die Expression beider Fusionsproteine wird mittels Durchflusszytometrie, Immunoblot und Laser-Scanning-Mikroskopie analysiert. Beide Fusionsproteine führen zu einer Steigerung der intrazellulären Cathepsin B-Expression, eine Assoziation der Fusionsproteine mit der Zellmembran kann allerdings nicht gezeigt werden. Der Einfluss der so gesteigerten Cathepsin-B-Expression auf die Lyse der RMA-Zellen durch zytotoxische T-Zellen wird im Chrom-Freisetzungs-Test analysiert. Zellen der Klone beider Konstrukte werden peptidspezifisch durch zytotoxische T-Zellen über den Granula-Exozytose-Weg lysiert und die Stärke der zytotoxischen Reaktion am Anteil lysierter Zielzellen gemessen. Hierbei zeigt sich, dass die Expression der Fusionsproteine durch die RMA-Zellen keinen Einfluss auf ihre Empfindlichkeit gegenüber zytotoxischen T-Zellen hatte. Ein Immune-Escape-Mechanismus, der auf der alleinigen Überexpression von Cathepsin B beruht, kann somit nicht gezeigt werden.