Auswirkungen von Östradiol, Bisphenol A und Octylmethoxycinnamat in östrogen-sensitiven Organen im Langzeitversuch an ovarektomierten Mäusen
Effects of estradiol, Bisphenol A and OMC on estrogen sensitive organs of ovarectomized mice under long-term treatment
von Carl Christian Opitz
Datum der mündl. Prüfung:2013-08-28
Erschienen:2012-07-04
Betreuer:Prof. Dr. Hubertus Jarry
Gutachter:Prof. Dr. Hubertus Jarry
Gutachter:Prof. Dr. Heide Siggelkow
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Name:Endfassung 20.08_SUB2.pdf
Size:547.Kb
Format:PDF
Zusammenfassung
Englisch
Introduction: Today our food, drinks etc. are often in contact with chemicals used in the fabrication for packing. More and more consumers are concerned whether these chemicals lead to an accumulation in the organism and consequently to health problems. Especially the influence of these so-called endocrine disruptors (ED’s) in the sensitive hormone homoeostasis must be cleared. A suitable animal model of the OECD to investigate estrogen or anti-estrogen effects is the ovarectomized rat. For further research in knock out mice no data existed for this species. Also most of the present studies have investigated estrogen effects for short-term treatment but not for long-term application. Therefore, in this study, we performed a three-month treatment of ovx mice to point out the possible effects of estradiol (E2) and the two endocrine disruptors Octyl- methoxycinnamate (OMC) and Bisphenol A (BPA) on the heart and other estrogen target organs (uterus, bone, hypophysis and liver). Furthermore, we measured differences in body weight and serumlipid levels under the influence of the above mentioned substances. Methods: Two-month old mice were ovx and fed with pelleted food containing 1000mg/kg OMC (equivalent to 3,54 mg OMC/animal/day); 500mg/kg Bisphenol A (equivalent to 1,62 mg BPA/animal/day) and Estradiol benzoate 4,32mg/kg (0.015mg/animal/day). Soy free chow was used as control. The mice were sacrificed after 3 months. After collecting blood for serum analysis, heart, liver and uterus were excised, weighted and stored at -70ºC until RNA isolation. The tibia was trimmed and stored for ex vivo bone mineral density measurement with computer-assisted tomography (CT). Gene expression of estrogen receptor alpha (ERα) and beta (ERß), insulin-like growth factor-I (IGF-1) , C3 and LHß was assessed by real time RT-PCR. Serum levels of E2 were measured by radioimmunoassay. In addition, Serumlipids (Cholesterol, Triglycerides, HDL and LDL) were measured by using commercial kits. Significant differences were defined at the P values < 0.05 using t-test. Result: Three month application of E2 resulted in physiological serum levels (30.1pg/ml) and induced the expected response in the uterus (11.8 fold increase of uterus weight/body weight ratio compared to control). E2 stimulated uterine gene expression of C3, ERβ and IGF-1, whereas OMC and BPA did not induce an uterotrophic effect. Liver weight increased in all of the compound treated groups but no effects on mRNA level of IGF- 1 were detected. Interestingly, heart weight and heart weight/BW ratio were elevated by E2 proving a hypertrophic effect of E2 in the heart in accordance with higher mRNA level of IGF-1 in the left ventricle muscle (p<0.05) that was not induced by OMC and BPA. E2 displayed osteoprotective effects by gaining higher cortical bone mineral density and total bone mineral density of the tibia. Conclusions: Estrogen showed the expected effects in ovx-mice. OMC and BPA had only slight estrogen effects without any uterotrophic induction. Probably the chosen concentration of the ED’s have been too low and a dose response relationship should be evaluated. Further studies are necessary in order to classify OMC and BPA uncritical in matter of causing estrogen effects in-vivo.
Keywords: estradiol; BPA; OMC; endocrine disruptors
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Einleitung:
Das Nahrungsmittel, Getränke usw. heutzutage immer mehr mit Verpackungsmaterialien in Verbindung kommen, die zu ihrer Herstellung Chemikalien benötigen, verunsichert viele Verbraucher. Es konnte noch nicht abschließend geklärt werden, ob diese Stoffe zu einer Akkumulation im Organismus führen und damit ein Gefährdungspotential für den Menschen darstellen. Auch der vermehrte Gebrauch von Pflegeprodukten erhöht die Exposition gegenüber künstlich hergestellten Inhaltsstoffen.
Ein validiertes Modell der OECD zur Untersuchung von Substanzen auf eine anti-/östrogene Wirkung ist jahrelang die ovarektomierte Ratte gewesen. Dabei wurde eine Testdauer von drei Tagen gewählt, was ungefähr der Zykluslänge einer Ratte entspricht. Um weitere Erkenntnisse zu erlangen, verwenden neuere Studien KO-Mäuse in ihren Arbeiten. Aufgrund der unterschiedlichen Nagerspezies lassen sich die früher an der Ratte gewonnenen Daten nicht mit denen von Mäusen vergleichen. Aus diesem Grund ist mit dieser Arbeit das Modell der ovarektomierten Maus etabliert worden.
Um mögliche Langzeiteffekte nicht zu übersehen, wurde ein Versuchsaufbau mit den Testsubstanzen Östradiol (E2), Bisphenol A (BPA) und Octyl-methoxycinnamat (OMC) über drei Monate gewählt und deren Wirkung auf Östrogen-sensitive Organe und Parameter hin untersucht.
Methodik:
Das Studiendesign beinhaltete 60 zwei Monate alte C-57-BL/6J–Mäuse, die nach Ovarektomie in 4 Gruppen aufgeteilt wurden. Über einen Zeitraum von drei Monaten stand der Kontrollgruppe sojafreies Futter zu Verfügung, die anderen Gruppen erhielten entweder Östradiol (4,32mg/kg sojafreies Futter), Bisphenol A (500mg/kg sojafreies Futter) oder OMC (1000mg/kg sojafreies Futter) versetzte Nahrung. Nach Tötung der Tiere wurde das Feuchtgewicht von Uterus, Leber und Herz sowie das Körpergewicht bestimmt. Die Genexpression von ERα (Uterus, Leber, Herz und Hypophyse) und ERβ (Uterus, Herz und Hypophyse) wurde per PCR analysiert. Die Expression der biologischen Marker für eine östrogene Wirkung, C3 (Uterus), IGF-1 (Uterus, Leber und Herz) und LHβ (Hypophyse), wurde untersucht und die Serumspiegel für Cholesterol, Triglyceride, HDL und LDL bestimmt. Zusätzlich wurde mittels Kleintier-CT eine Messung der Spongiosa- und Kortikalisdichte in der linken Tibia durchge!
führt.
Ergebnisse:
Die Applikation der errechneten E2-Dosis führte zu den erwarteten Effekten an den Zielorganen (11,8 fachen Anstieg des relativen Uterusgewichts) und zu einer adäquaten Erhöhung des Serumestradiolspiegels. E2 führte zu einer vermehrten uterinen Genexpression von C3, ERß und IGF-1 während OMC und BPA keinen uterotrophen Effekt aufwiesen. Das absolute Lebergewicht zeigte sich zwar unter dem Einfluss aller Substanzen erhöht, jedoch ohne jedwede Veränderung in der Genexpression. Interessanterweise kam es unter der Applikation von E2 p.o. zu einer signifikanten Steigerung des Herzgewicht und dementsprechender Mehrexpression der IGF-1-mRNA in den Herzmuskelzellen. Dieser Effekt ließ sich für keines der endokrinen Disruptoren nachweisen. Die Applikation von Östradiol zeigte einen positiven Einfluss auf die trabekuläre Dichte im Bereich der Tibiametaphyse der Versuchstiere.
Zusammenfassung:
Auch im Modell der ovx-Maus können die erwarteten Effekte des Goldstandards E2 nachgewiesen werden. So kann z.B. eine ausgeprägte uterotrophe Wirkung, sowie eine signifikante Verbesserung der Knochenstrukturen im Vergleich zu den Steroid-depletierten ovx-Mäusen beobachtet werden. Solche Effekte wurden nicht durch OMC oder BPA hervorgerufen. Ob dieser fehlende endokrinologische Effekt der beiden getesteten Industriechemikalien auf eine zu geringe Dosierung und/oder einer unzureichenden Applikationsdauer beruht, muss in weiteren Studien geprüft werden, bevor OMC und BPA bezüglich einer östrogenartigen Wirkung in-vivo als unbedenklich eingestuft werden können.
Schlagwörter: stradiol; BPA; OMC; Endokrine Disruptoren