CIN85/CD2AP-based protein complexes in B cell antigen receptor signalling

CIN85/CD2AP-basierte Proteinkomplexe in der B-Zell Antigen Rezeptor Signalleitung

von Vanessa Bremes
Dissertation
Datum der mündl. Prüfung:2012-06-21
Erschienen:2012-07-12
Betreuer:Prof. Dr. Jürgen Wienands
Gutachter:Prof. Dr. Jürgen Wienands
Gutachter:Dr. Henning Urlaub
Gutachter:Dr. Dieter Klopfenstein
Zum Verlinken/Zitieren: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-1570

 

 

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Zusammenfassung

Englisch

Early B cell antigen receptor (BCR) signal transduction involves formation of multimeric protein complexes and their recruitment to BCR-containing areas in the plasma membrane. One such membrane-targeted signalosome is the Ca2+ initiation complex that is assembled on the central adaptor protein SH2 domain-containing leukocyte protein of 65 kDa (SLP65). To decipher the mechanism of SLP65 membrane localisation, the interactome of SLP65 was analysed by our group and identified the scaffolds Cbl-interacting protein of 85 kDa (CIN85) and CD2-associated protein (CD2AP) to be constantly associated with SLP65. Further studies showed that disruption of this interaction by changes of SLP65 binding motifs resulted in impaired BCR-induced Ca2+ mobilisation in DT40 and primary murine B cells. Hence, the following questions arose for this thesis: Does ablation of CIN85 and CD2AP result in a BCR-induced Ca2+ mobilisation defect as shown on the SLP65 side and, thus, do CIN85, CD2AP and SLP65 comprise a preformed signal transducer complex? And, how do CIN85 and CD2AP then contribute to SLP65 function in BCR signal transduction? In my thesis, I demonstrated that CIN85 positively regulated the rapid onset and strength of BCR-induced Ca2+ mobilisation in DT40 B cells. However, CD2AP could partially replace CIN85 function in this respect. Using live cell imaging I showed that CIN85 and CD2AP translocate to the plasma membrane upon stimulation of the BCR, but used different anchoring modes. Interestingly, the very same domains of CIN85 necessary for BCRinduced Ca2+ signalling provided CIN85 with access to the plasma membrane. More detailed analysis of membrane localisation using total internal reflection microscopy identified CIN85 to colocalise with BCR-containing microclusters upon BCR engagement. In contrast to CIN85 only very few CD2AP molecules were found in these microclusters. Importantly, the preformation of CIN85 with SLP65 could be bypassed by providing SLP65 with direct access to the BCR. This implies that CIN85 and SLP65 comprise a preformed BCR transducer module. In this complex CIN85 targets SLP65 directly to BCR-containing microclusters thereby enabling efficient BCR-induced Ca2+ responses. Collectively, the herein documented results contribute to the understanding of BCR activation with respect to BCR-proximal signalosomes and their importance in the transduction of BCR signals.
Keywords: BCR; Calcium; CD2AP; CIN85; SLP65

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Die frühe B-Zell Antigen Rezeptor (BZR) Signalleitung ist charakterisiert durch die Bildung multimerer Proteinkomplexe und deren Rekrutierung in BZR-reiche Domänen der Plasmamembran. Ein solcher Membran-assoziierter Signalkomplex ist der Ca2+- Initiationskomplex, der sich um das zentrale Adaptorprotein SH2-domain-containing leukocyte protein of 65kDa (SLP65) formiert. Um den Mechanismus der Plasmamembranlokalisation von SLP65 weiter zu entschlüsseln, wurde in unserer Gruppe das SLP65 Interaktom analysiert. Dadurch konnten die Adaptorproteine Cbl-interacting protein of 85kDa (CIN85) und CD2-associated protein (CD2AP) als konstitutive Interaktionspartner von SLP65 identifiziert werden. Weitere Studien zeigten, dass die Verhinderung dieser Interaktion durch eine Veränderung der Bindemotive in SLP65 zu einer verminderten BZR-induzierten Ca2+ Mobilisierung in DT40 und primären, murinen B Zellen führte. Somit ergaben sich folgende Fragen für diese Arbeit: Resultiert das Ausschalten von CIN85 und CD2AP in einem Defekt in der Ca2+ Mobilisierung – wie von SLP65 Seite gezeigt, und bilden CIN85, CD2AP und SLP65 somit einen präformierten Signaltransduktionskomplex? Wie unterstützen CIN85 und CD2AP die Funktion von SLP65 in der BZR Signalleitung? In dieser Arbeit konnte ich zeigen, dass CIN85 den Beginn und die Stärke der Ca2+ Mobilisierung in DT40 B Zellen positiv reguliert. Allerdings kann CD2AP diese Funktion von CIN85 teilweise ersetzen. Durch Konfokalmikroskopie lebender Zellen konnte ich zeigen, dass CIN85 und CD2AP nach BZR-Stimulation zur Plasmamembran rekrutiert werden, aber dafür unterschiedliche Verankerungsmechanismen benutzten. Interessanterweise, waren genau die Domänen in CIN85, die essentiell für die Ca2+ Mobilisierung waren, auch nötig für dessen Plasmamembranlokalisation. Eine genauere Analyse der Membranlokalisierung durch Interne Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie ergab, dass CIN85 nach BZR-Stimulation mit BZR-reichen Mikroclustern kolokalisiert. Im Gegensatz zu CIN85 konnten nur sehr wenige CD2AP Moleküle in diesen Mikroclustern gefunden werden. Wichtig in diesem Zusammenhang ist, dass die Präformation von CIN85 und SLP65 durch direkte BCR-Lokalisation von SLP65 umgangen werden konnte. Dies impliziert, dass CIN85 und SLP65 einen präformierten BZR-Signalleitungskomplex bilden. In diesem Komplex bringt CIN85 SLP65 direkt in die BZR-reichen Mikrocluster und ermöglicht somit eine effiziente BZR-induzierte Ca2+ Antwort. Zusammengefasst, tragen die hier dokumentierten Ergebnisse zum Verständnis der B-Zell Aktivierung insbesondere BZR-proximaler Signalkomplexe und deren Wichtigkeit in der Weiterleitung von BZR-Signalen bei.
Schlagwörter: BZR; Calcium; CD2AP; CIN85; SLP65
 
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