Proteomische Analyse eines in-vitro-Modells für die interstitielle renale Fibrose: Der osmotische Stress als Fibrose-triggernder Faktor
Proteomic analysis of in vitro Model for interstitial renal fibrosis: The osmotic stress as fibrosis triggering factor
by Loubna Lahrichi
Date of Examination:2012-08-07
Date of issue:2012-07-27
Advisor:Prof. Dr. Hassan Dihazi
Referee:Prof. Dr. Hassan Dihazi
Referee:Dr. Henning Urlaub
Referee:Prof. Dr. Martin Oppermann
Files in this item
Name:lahrichi.pdf
Size:2.00Mb
Format:PDF
Abstract
English
Renal fibrosis (RF) is the final stage of many renal diseases leading to organ function loss. RF is characterised by the deposition and accumulation of extracellular matrix components (ECM). Renal fibroblasts are playing a major role in this process. To identify mechanisms associated with renal interstitial fibrosis, we performed a differential proteomic analysis of two established immortalized cell lines, normal kidney fibroblasts (TK173) and fibrotic kidney fibroblasts (TK188). 2-D electrophoresis combined with mass spectrometry analysis revealed the alteration of 43 proteins in TK188 compared to TK173. Among these proteins were markers that have been described to be involved in fibrogenesis (e.g. FIN, ACTA2, VIN, VIM, DES and KRT), protein markers of the ER stress and the unfolded protein response (UPR) pathway (GRP78, GRP94, ERP57, ERP72, PDI and CALR) and proteins of the oxidative stress pathway (PRDX1, PRDX2, PRDX6, SOD, PARK7 and HYOU1). All these proteins were highly upregulated in TK188 cells. The results of selected proteins were confirmed by western blot and immunofluorescence staining. The upregulation of stress proteins in the fibrotic cell line suggests a correlation between the activation of stress pathways and the development of fibrosis. After long time exposition of TK173 to osmotic stress with high NaCl concentration, we observed a transformation of the stressed cell line (TK173-NaCl) in a TK188-like phenotype. The proteomic analysis shows an alteration in the expression of 27 proteins in TK173-NaCl compared to TK173. 22 proteins were upregulated. Among them were fibrosis markers, proteins of ER stress and oxidative stress. The results of selected proteins were confirmed by western blot and immunofluorescence staining. Based on proteomic analysis of in vitro cell model for renal fibrosis (TK173/TK188), we identified typical fibrosis markers and illustrated the role of different stress pathways in fibrosis. We could also show the profibrotic effect of osmotic stress on renal fibroblasts through activation of oxidative stress and ER stress pathways.
Keywords: Renal fibrosis; kidney fibroblasts; 2D electrophoresis; mass spectrometry; Western blot; immunofluorescence staining; ER stress proteins; UPR pathway; fibrosis marker; oxidative stress; osmotic stress
Other Languages
Die renale Fibrose stellt das Endstadium
vieler Nierenerkrankungen dar und führt zum Organfunktionsverlust.
Charakteristisch für die Fibrose ist die exzessive Akkumulation von
Proteinen der extrazellulären Matrix (ECM). Dabei spielen die
renalen Fibroblasten eine Schlüsselrolle. Um näheres über die
genauen zellulären und molecularen Mechanismen der renalen Fibrose
zu erfahren, führten wir eine vergleichende proteomische Analyse
von zwei etablierten immortalisierten Zelllinien durch,
nichtfibrotische Nierenfibroblasten (TK173) und fibrotische
Nierenfibroblasten (TK188). Die Analyse beinhaltete die
2D-Gel-Elektrophorese und die Massenspektrometrie. Hierbei konnten
43 unterschiedlich exprimierte Proteine zwischen den beiden
Zelllinien identifiziert werden. Darunter waren Fibrosemarker
(z.B.: FIN, ACTA2, VIN, VIM, DES und KRT), Proteinmarker des ER
(endoplasmatisches Retikulum)-Stresses und des UPR (unfolded
protein response)-Pathways (GRP78, GRP94, ERP57, ERP72, PDI und
CALR) sowie Proteine des oxidativen Stresses (PRDX1, PRDX2, PRDX6,
SOD, PARK7 und HYOU1) in der fibrotischen Zelllinie TK188
hochreguliert. Bei selektierten Proteinen wurden die Ergebnisse
durch Western-Blot und Immunfluoreszenz-Färbung bestätigt. Die
Tatsache, dass die Proteine der Stresspathways in der fibrotischen
Zelllinie hochreguliert waren, deutete auf einen möglichen
Zusammenhang zwischen Aktivierung dieser Stresspathways und der
Fibrose-Entwicklung hin. Dies wurde im zweiten Teil der Arbeit
überprüft . Die nichtfibrotische Zelllinie (TK173) wurde einem
osmotischen Stress mit hoher NaCl-Konzentration über lange Zeit
ausgesetzt. Hierbei entwickelte sich ein fibrotischer
TK188-ähnlicher Phänotyp. Die proteomische Analyse zeigte
signifikante Expressionsänderungen von 27 Proteinen in der
gestressten Zelllinie (TK173-NaCl) im Vergleich zu der normalen
Zelllinie (TK173), davon 22 Proteine hochreguliert. Unter diesen
Proteinen waren Fibrosemarker, ER-Stressproteine und Proteine des
oxidativen Stresses. Bei ausgewählten Proteinen lieferten die
Western-Blot-Analyse und die Immunfluoreszenzfärbung eine
Bestätigung der Ergebnisse. In unserer Arbeit gelang es uns durch
die proteomische Analyse eines in-vitro-Zellmodells (TK173/TK188)
für die renale Fibrose, die identifizierung von typischen
Fibrose-Markern und die Erkennung der Rolle einiger Stress-Pathways
bei der Fibrose . Ferner wurde der Fibrose-triggerende Effekt des
osmotischen Stresses über Aktivierung des oxidativen und ER-Stress
nachgewiesen.
Schlagwörter: Renale Fibrose; Nierenfibroblasten; 2D-Gelektrophorese; Massenspektrometrie; Westernblot; Immunfluoreszenzfärbung; ER-Stress-Proteine; UPR-Pathway; Fibrosemarker; oxidativer Stress; osmotischer Stress