Single-molecule experiments with mitotic motor proteins

Abstract

Die vorliegende kumulative Doktorarbeit beinhaltet in fünf Kapiteln (Kapitel 2, 3, 4, und 5 bestehend aus publizierten Veröffentlichungen und Kapitel 6 bestehend aus einem eingereichten Manuskript) neue Erkenntnisse über unterschiedlicher Aspekte der Regulation von mitotischen kinesin-5 Motorproteinen. Außerhalb des Themas der kinesin-5-Regulation besteht Kapitel 7 aus einer publizierten Veröffentlichung über zellulare Motilität neuronaler Rezeptoren, zu der ich in vivo Messungen in Neuronen mittels TIRF-Mikroskopie beigetragen habe. In Kapitel 2 wurden Faktoren untersucht, die Richtungsänderungen in Cin8 - eines der zwei kinesin-5 Motorproteine in Saccharomyces cerevisiae - verursachen. Bisher wurde angenommen, dass Motorproteinen eine bestimmte, feste Bewegungsrichtung durch ihre Molekularstruktur vorgegeben ist. Die gerichtete Bewegung von kinesin-5 erfolgt nach bisherigem Kenntnisstand stets und unidirektional in Richtung des Plus-Endes des Mikrotubulus (MT). Die hier präsentierten Ergebnisse und die von dieser Arbeit unabhängigen, zeitgleich veröffentlichen Daten einer aktuellen Studie von Roostalu et al. zeigten jetzt allerdings, dass Cin8 wider Erwarten in der Lage ist seine Bewegungsrichtung zu ändern. In der vorliegenden Studie wurde die Direktionalität von Cin8 in vitro mittels Einzelmolekül-Fluoreszenz in Motilitätsexperimenten und in vivo mittels live-cell-Mikroskopie untersucht. Die in-vitro-Experimente zeigten, dass die Bewegungsrichtung einzelner Cin8 Motorproteine entlang eines MT durch Verringerung der Ionenstärke im Puffer von schneller, prozessiver zum Minus-Ende gerichteter Bewegung zu langsamer zum Plus-Ende gerichteter Bewegung „umgeschaltet“ werden konnte. Hinweise auf einen physiologisch relevanteren Regulationsmechanismus gab das interessante Ergebnis, dass die Motilität von Cin8 stark durch die Bindung eines zweiten MT beeinflusst wurde: in Puffer mit hoher Ionenstärke bewegte sich Cin8 schnell und prozessiv in Richtung Minus-Ende eines einzelnen MT und änderte seine Motilität schlagartig hin zu schnell alternierender Direktionalität sobald ein zweiter, antiparalleler MT gebunden wurde. Die Motilität mit alternierender Direktionalität bewirkte gleichzeitig eine gleichmäßige relative Verschiebung des zweiten MT in Richtung Plus-Ende. Dieses außergewöhnliche Verhalten von Cin8 könnte bei der Regulation seiner unterschiedlichen Funktionen in der mitotischen Spindel eine entscheidende Rolle spielen. In Kapitel 3 wurde durch Einzelmolekül-Fluoreszenz in-vitro-Experimente bestätigt, dass bei niedriger Ionenstärke einzelne Cin8 Moleküle in der Lage sind, ihre Motilität bidirektional umzuschalten. Mittels Intensitätsanalyse der Kymographen von GFP-markierten Cin8 Motorproteinen in Niedrigsalzpuffer konnte die von Roostalu et al. postulierte Möglichkeit ausgeschlossen werden, dass Cluster-Formation der Cin8 Moleküle notwendig ist, um Motilität in Richtung Plus-Ende zu initiieren. Die Ergebnisse bekräftigen die These, dass die Direktionalität einzelner Cin8 Moleküle durch die Bindung von Ladung reguliert wird und nicht durch mechanische Kopplung zwischen zwei oder mehreren Motorproteinen. In Kapitel 4 wurde der Einfluss des kinesin-5-Inhibitor-Moleküls Monastrol auf die Motordomäne von kinesin-5 aus Xenopus laevis (Eg5) untersucht. Für diese Studie wurde eine stabile, dimere kinesin-1 stalk/kinesin-5 head Chimaere (Eg5Kin) konstruiert, die aus der Motordomäne und der neck-linker-Region von Eg5 und der neck-coiled-coil-Region von Drosophila melanogaster kinesin-1 (DmKHC) besteht. In Einzelmolekül-Fluoreszenz Experimenten zeigte diese Chimaere - im Gegensatz zu Wildtyp Eg5 - eine hohe Prozessivität und keinerlei diffusive Moden in ihrer Motilität. Die Zugabe des Eg5-Inhibitors Monastrol zu dem Einzelmolekül-Experiment führte zu einer Reduktion der Länge der prozessiven Läufe, beeinflusste aber überraschenderweise nicht die Geschwindigkeit von Eg5Kin. Eine Reihe von Experimenten mit sukzessiv zunehmender Monastrol-Konzentration ließ schließlich den Schluss zu, dass die Bindung eines einzelnen Monastrol-Moleküls an ein Eg5Kin-Dimer nicht ausreicht, um dessen prozessiven Lauf zu stoppen, sondern dass die simultane Bindung von zwei Monastrol-Molekülen nötig ist, um das Dimer zu inhibieren, d.h. seinen Lauf zu stoppen. In Kapitel 5 wurde der Einfluss der neck-linker-Länge auf die prozessive Motilität von zwölf dimeren kinesin-1 stalk/kinesin-5 head Chimaeren, die auf Eg5Kin basieren, untersucht. Bei diesen Motorprotein-Konstrukten wurde die neck-linker-Länge variiert und reichte von 9 Aminosäuren (AS) über die nativen 18 AS bis hin zu 21 AS des Wildtyp Eg5 neck-linker. Bei einer weiteren Chimaere wurden 3 Proline zu den nativen 18 AS von Eg5 hinzugefügt, um eine artifizielle neck-linker-Verlängerung zu erzeugen. Mittels Multi-Motor-Gleit-Experimenten mit TMR-markierten MTs wurde zunächst bestätigt, dass alle Konstrukte aktive Motorproteine sind. Mit Einzelmolekül-Fluoreszenz Experimenten und mit Experimenten in einer optischen Falle wurden die Konstrukte auf Einzelmolekül-Level bezüglich Geschwindigkeit, Lauflänge und Kraft getestet. Die Experimente zeigten, dass weder die Geschwindigkeit noch die erzeugte Kraft von der neck-linker-Länge abhing. Doch interessanterweise hatte die neck-linker-Länge einen deutlichen Einfluss auf die Lauflänge der unterschiedlichen Konstrukte: die neck-linker-Länge nahe der nativen neck-linker-Länge von Eg5 (17 und 18 AS) ermöglichte Lauflängen, die zwei Mal so lang waren wie die der Konstrukte mit 13 bis 16 AS. Um zu überprüfen ob nahe der nativen neck-linker-Länge von Eg5 tatsächlich maximale Lauflängen erzielt werden, wurden Konstrukte mit noch längeren neck-linker-Längen (19 bis 21 AS) untersucht. Hierbei wurde in der Tat eine Abnahme der Lauflänge mit Zunahme der neck-linker-Länge festgestellt. Diese Ergebnisse stellen das kürzlich von Shastry et al. postulierte einfache und generelle Model, in dem eine kurze neck-linker-Länge zu der direktesten Kommunikation zwischen den Motordomänen und damit zu den längsten Lauflängen führt, in Frage. Stattdessen weisen die Ergebnisse darauf hin, dass unterschiedliche kinesine mit unterschiedlichen Funktionen möglicherweise auch auf unterschiedliche neck-linker-Längen optimiert sind. In Kapitel 6 wurde mittels einer tetrameren kinesin-1 head/kinesin-5 tail Chimaere das Umschalten zwischen diffusiver und prozessiver Motilität untersucht. Bei diesem chimaeren Motorprotein-Konstrukt (DK4mer) wurde die Motordomäne von Xenopus l. Eg5 durch die entsprechenden Teile von Drosophila m. kinesin-1 ersetzt, wodurch ein schnelles, prozessives und MT-gleitendes Motorprotein erzeugt wurde. Da in früheren Studien von Kapitein et al. gezeigt wurde, dass die Motilität von Wildtyp Eg5 aus einer Kombination von diffusiven und prozessiven Moden besteht, war das Ziel dieser Studie, das Umschalten von diffusiver zu prozessiver Motilität genauer zu untersuchen. Einzelmolekül-Fluoreszenz Experimente zeigten, dass DK4mer sich in vitro entlang einzelner MTs schnell und prozessive bewegt, wobei diese Bewegung durch diffusive Pausen unterbrochen wurde. Wenn kein ATP im Motilitätspuffer enthalten war, diffundierte DK4mer - ähnlich wie Eg5 - entlang eines einzelnen MT. MT-Gleit-Experimenten zeigten, dass DK4mer in der Lage war antiparallele MTs auseinander zu schieben, und bestätigten damit, dass DK4mer ein vollfunktionales Tetramer ist. Im Vergleich zu Eg5 waren bei DK4mer klare Unterschiede zwischen diffusiven und prozessiven Motilitätsmoden zu erkennen, was es ermöglichte Übergangsraten als Funktion der Ionenstärke im Motilitätspuffer zu bestimmen. Die Ergebnisse dieser Studie deuten darauf hin, dass die zwei Motilitätsmoden von DK4mer zwei unabhängigen und möglicherweise einander ausschließenden Interaktionsmoden mit dem MT entsprechen. Diese unterschiedlichen MT-Interaktionsmoden könnten auch für die Regulation von nativen kinesin-5 Motorproteinen relevant sein.