Biochemical and functional differences of chromatin assembled replication-coupled or independent in Xenopus laevis egg extracts

Abstract

Zwei grundsätzliche Assemblierungswege sorgen für die korrekte Weitergabe von Chromatinstrukturen und Chromatin-basierender Informationen während des Zellzyklus. Ein replikationsabhängiger (RA) Weg, bei dem die Assemblierung an die DNA-Synthese gekoppelt ist und eine replikationsunabhängiger (RU) Weg. Inwiefern beide Prozesse zur Etablierung von spezialisierten Chromatinbereichen, wie Heterochromatin und Euchromatin, durch post-translationale Modifizierungen an Histonproteinen oder Veränderungen der Chromatinstruktur beitragen, ist nicht bekannt. Mit Hilfe von Xenopus laevis Eiextrakten wurde die RA und RU Chromatinassemblierung auf einzel- bzw. doppelsträngiger DNA untersucht. Obwohl der RA Assemblierungsprozess schneller ablief, enthalten beide Chromatinspezies vergleichbare Mengen an Histonen und einen ähnlichen Saturierungsgrad an Nukleosomen. Trotz dieser vergleichbaren topologischen Eigenschaften, zeigen die beiden erzeugten Chromatinarten ein unterschiedliches Verhalten in Sucrosedichtegradienten. Hierbei reicherte sich das RA-erzeugte Chromatin bei niedrigeren Sucrosekonzentrationen an, was Rückschlüsse auf eine unterschiedliche Kompaktierung des Chromatins zulässt. AFM Studien bestätigten, dass beide Chromatinspezies diskrete Strukturen ausbildeten. Als nächstes wurde die biochemische Zusammensetzung des RA und RU erzeugten Chromatins analysiert. Massenspektrometrische Analysen von Chromatin-assoziierten Proteinen zeigten, dass es unterschiedlichen Gruppen von Proteinen gibt, die entweder in beiden Prozessen oder nur einem von beiden eine Rolle spielen. Die Histonvariante H3.3 zum Beispiel wurde ausschließlich während der RU Assemblierung inkorporiert. Im Gegensatz dazu konnten die Histonvarianten H3.2 und H2A.Z als Bestandteile beider Assemblierungswege identifiziert werden. Innerhalb des RU Assemblierungsweges konnten außerdem Methylierung von H3K4 und Monomethylierung von H4K20 gefunden werden. Keine dieser Methylierungsmuster konnte während der RA Chromatinassemblierung nachgewiesen werden. Der Einbau der Methylierungen scheint unabhängig voneinander stattzufinden, denn die Monomethylierung von H4K20 durch PR-Set7 fand unabhängig von bereits vorhandener H3K4 Methylierung statt. Desweiteren kann eine Rekrutierung von PR-Set7 zum Assemblierungsvorgang durch HIRA, dem zentralen Protein des RU Assemblierungsweges, ausgeschlossen werden. Immunopräzipitationstudien dagegen zeigten, dass HIRA im Eiextrakt mit einer H3K4 Methyltransferase assoziiert. Die beschriebenen biochemischen Unterschiede legten die Vermutung nahe, dass auch Unterschiede auf transkriptioneller und demnach funktioneller Ebene bestehen könnten. Die Transkriptionsanalyse von extrahierten Chromatin belegte, dass der RU Assemblierungsweg zu transkriptionell aktiven Chromatin führte, wogegen RA-erzeugtes Chromatin nicht transkriptionell zugängig war. Die Blockierung jeglicher Methylierung durch SAH veränderte dabei nicht nur die Struktur des RU assemblierten Chromatins, sondern reduzierte auch dessen transkriptionelle Aktivität. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die RA und RU Assemblierungswege Chromatinspezies generiert, welche sich auf struktureller, biochemischer und funktionaler Ebene unterscheiden. Die de novo Assemblierung während der Replikation erzeugt eine transkriptionell inaktive Chromatinstruktur im Gegensatz zum transkriptionell aktiven Chromatin des RU Assemblierungsweges. Die Tatsache das RU Chromatinassemblierung außerhalb der S-Phase stattfindet, legt nahe dass dieser Prozess dafür genutzt werden kann, um die transkriptionelle Aktivität bestimmter genomischer Regionen nach Ende der S-Phase wiederherzustellen.