Methods to improve the sample quality of macromolecular complexes for structure determination by 3D Electron Cryo-Microscopy
Methoden zur Verbesserung der Probenqualität makromolekularer Komplexe zur Strukturbestimmung mittels 3D Kryo-Elektronenmikroskopie
by Florian Peter Platzmann
Date of Examination:2012-02-24
Date of issue:2012-05-15
Advisor:Prof. Dr. Holger Stark
Referee:Prof. Dr. Holger Stark
Referee:Prof. Dr. Reinhard Lührmann
Referee:Prof. Dr. Ralf Ficner
Persistent Address:
http://dx.doi.org/10.53846/goediss-3187
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Abstract
English
Macromolecular assemblies often undergo substantial structural rearrangements. Not only do functional states differ from each other, a single functional state also exhibits inherent conformational heterogeneity. A typical example is the yeast spliceosomal B-complex before and after catalytic activation by Prp2. Electron microscopy datasets of both states were compared and it could be verified that the complex undergoes a significant structural remodelling upon activation. Conformational heterogeneity limits the resolution of the 3D electron microscopy reconstruction or necessitates the solution of several distinct substructures – an often time consuming process that also requires large datasets. For many cases, reduction of conformational freedom within the sample would be advantageous: More structural information could be gained from a smaller dataset. The GraFix preparation protocol significantly improves the sample quality of macromolecules by stabilizing the sample chemically with glutaraldehyde, a crosslinking reagent, in a density gradient. Both chemical and physical modifications of the protocol were tested. Several compounds were added to the gradient and their effects on heterogeneity were evaluated on the 2D-level. However, the modifications did not lead to a definitive improvement in sample quality. Efforts were refocused on the temperature at which the sample is exposed to the crosslinking reagent. It was evaluated whether a fixation at temperatures below 0 °C would affect the sample to adopt a thermodynamically favoured conformation and basically “freeze” movement within the structure. To account for reduced glutaraldehyde activity at lower temperatures, the fixation conditions were optimized using glutamate dehydrogenase as a model assembly. As a proof of principle, 70S ribosome samples were subjected to cryo-fixation. Their distribution of intersubunit rotation angles was compared to that of data recorded with standard-GraFix-prepared samples as well as unfixated samples. The cryo-fixated samples showed a noticeably higher homogeneity in their conformational distribution. It was proven that glutaraldehyde fixation can stabilize a conformational state at lower exposure temperature and retain it even upon subsequent warming to higher preparation temperatures. Thus, the “CryoFix protocol” was established, which further limits heterogeneity. This is one more step towards higher quality EM-structures.
Keywords: Electron Cryo-Microscopy; sample preparation
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Makromolekulare Komplexe durchlaufen oft erhebliche strukturelle Veränderungen. Nicht nur unterscheiden sich die funktionellen Zustände voneinander, sondern ein einzelner funktioneller Zustand zeigt auch in sich konformationelle Heterogenität. Ein typisches Beispiel ist der Hefe spleißosomale B-Komplex vor und nach seiner katalytischen Aktivierung durch Prp2. Elektronenmikroskopie-Datensätze beider Zustände wurden verglichen und es konnte bestätigt werden, dass der Komplex bei der Aktivierung eine signifikante strukturelle Umgestaltung erfährt. Konformationelle Heterogenität begrenzt die Auflösung der 3D elektronenmikroskopischen Rekonstruktion oder erfodert die Lösung mehrerer unterschiedlicher Unterstrukturen - ein meist zeitaufwändiger Vorgang, der große Datensätze benötigt. In vielen Fällen wäre die Verringerung der konformationellen Freiheit von Vorteil: Mehr strukturelle Information könnte aus einem kleineren Datensatz gewonnen werden. Das GraFix Präparationsprotokoll verbessert die Probenqualität von Makromolekülen erheblich, indem es die Probe innerhalb eines Dichtegradienten chemisch mit dem Crosslinker Glutaraldehyd stabilisiert. Chemische und physikalische Modifikationen des Protokolls wurden untersucht. Mehrere Verbindungen wurden dem Gradienten zugesetzt und ihr Einfluss auf die Heterogenität wurde auf der 2D-Ebene ausgewertet. Allerdings führten die Modifikationen nicht zu einer eindeutigen Verbesserung der Probenqualität. Die Bemühungen wurden daher auf die Temperatur, bei der die Probe dem Crosslinker ausgesetzt wird, verlagert. Es wurde ausgewertet, ob eine Fixierung bei Temperaturen unterhalb von 0 °C die Probe in eine thermodynamisch bevorzugte Konformation bringen und die Bewegung innerhalb der Struktur sozusagen "einfrieren" könnte. Um die verringerte Glutaraldehyd-Aktivität bei niedrigerer Temperatur auszugleichen, wurden die Fixierungsbedingungen mit Hilfe von Glutamat-Dehydrogenase als Modellsystem optimiert. Als Grundlagenbeweis wurden 70S Ribosomproben kryofixiert. Die Verteilung der Rotationswinkel ihrer Untereinheiten wurde mit der von herkömmlich GraFix-behandelten, sowie mit der von unfixierten Proben verglichen. Die kryofixierten Proben zeigten eine merklich höhere Homogenität in ihrer Konformationsverteilung.
Es konnte gezeigt werden, dass die Glutaraldehyd-Fixierung in der Lage ist, einen konformationellen Zustand bei niedrigerer Temperatur zu stabilisieren und diesen selbst bei anschließender Erwärmung auf eine höhere Präparationstemperatur beizubehalten. Damit wurde das "CryoFix-Protokoll" eingeführt, welches die Heterogenität weiter einschränkt. Dies ist ein weiterer Schritt auf dem Weg zu höherwertigen EM-Strukturen.
Schlagwörter: Kryo-Elektronenmikroskopie; Probenvorbereitung