Development of Fluorescence Activated Synaptosome Sorting (FASS) and analysis of VGLUT1 synapses from mouse brain

Abstract

Im Gehirn werden Signale zwischen Nervenzellen an chemischen Synapsen übermittelt. Ob eine Synapse dabei erregende, hemmende oder modulatorische Signale überträgt, hängt von den beteiligten Neurotransmittern und deren Neurotransmitter-Rezeptoren ab. Um die physiologische Funktion dieser unterschiedlichen synaptischen Subtypen und deren Beteiligung an pathologischen Prozessen im Gehirn zu untersuchen, ist die detaillierte Kenntnis ihrer biochemischen Zusammensetzung eine notwendige Vorraussetzung. Um die Proteinzusammensetzung und Funktion von Synapsen zu erforschen, fanden in den letzten Jahrzehnten Synaptosomenpräparationen breite Anwendung in der Wissenschaft. Als Synaptosomen bezeichnet man funktionelle synaptische Einheiten, die sowohl die Prä- als auch die Postsynapse enthalten und die seit 1960 routinemäßig mittels differentieller und Dichtegradientenzentrifugation aus Hirngewebe isoliert werden. Die Interpretation der von Synaptosomenpräparationen gewonnen Daten wird allerdings dadurch erschwert, dass die konventionelle Synaptosomenpräparation ein Gemisch von synaptischen Partikel aller synaptischen Subtypen enthält und durch einen beträchtlichen Anteil nicht-synaptischer Partikel, die von Glia und Neuronen stammen, verunreinigt ist. In der vorliegenden Arbeit habe ich zur weiteren Spezifizierung eine neue Methode entwickelt, welche die konventionelle Synaptosomenpräparation um die spezifische Selektion von fluoureszenten Synaptosomen mittels eines FACS-Gerätes erweitert. Hierbei diente eine vor kurzem in unserer Arbeitsgruppe entwickelte fluoreszente VGLUT1VENUS knock-in Mauslinie als Quelle fluoreszenter VGLUT1-Synapsen. Im Folgenden zeige ich, dass durch die von mir als „Flourescent Activated Synaptosome Sorting“ (FASS) bezeichnete Methode äußerst reine VGLUT1-Synaptosomen isoliert werden, die sowohl prä- als auch postsynaptische Bestandteile enthalten. Die weitere Untersuchung der FASS-aufgereinigten VGLUT1VENUS-Synaptosomen liefert Erkenntnisse über die synaptische Verteilung der Neuroligine und zeigt Unterschiede in der Verteilung von Glutamatrezeptoren zwischen synaptischen und extrasynaptischen Zonen. Eine Proteomanalyse zeigt die spezifische Anreicherung von 163 Proteinen in VGLUT1-Synapsen. Darunter sind viele bekannte synaptische Proteine, aber auch eine Vielzahl von Proteinen, für die noch keine Daten zur Lokalisation an VGLUT1-Synapsen vorliegen. Für drei dieser Proteine, nämlich FXYD6, Ly6H und TPD52, wird die Expression und Lokalisation an VGLUT1-Synapsen mit unabhängigen Methoden bestätigt. Zusammengenommen zeigt die vorliegende Arbeit, dass FASS ein neues und adäquates Verfahren für die Anreicherung von höchst reinem synaptischen Material ist, welches verwendet werden kann, um spezifische synaptische Subtypen in biochemischen, physiologischen oder pathophysiologischen Studien zu untersuchen.