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Synaptic Ultrastructure and Regulation of Synaptic Transmission in Caenorhabditis elegans

Synaptische Ultrastruktur und Regulation der Synaptischen Transmission in Caenorhabditis elegans

by Maike Kittelmann
Doctoral thesis
Date of Examination:2012-06-21
Date of issue:2012-11-07
Advisor:Prof. Dr. Stefan Eimer
Referee:Prof. Dr. Stefan Eimer
Referee:Prof. Dr. André Fiala
Referee:Prof. Dr. Martin Göpfert
crossref-logoPersistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-3269

 

 

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Format:PDF
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Abstract

English

The triggered release of synaptic vesicles (SVs) is tightly regulated in time and space by an elaborate network of proteins forming the active zone (AZ). When visualized by electron microscopy (EM), a morphological hallmark of the presynaptic AZ is an electron dense projection (DP) situated at the center of the AZ and extending into the cytoplasm. DPs are surrounded by a cluster of clear core SVs and have been proposed to play an important role in organizing and regulating SV release. However, our knowledge about its molecular composition, assembly mechanisms, and high-resolution 3D structure are limited. The neuromuscular junction (NMJ) of the nematode Caenorhabditis elegans provides an easily accessible model system to study AZ assembly, structure and function in regulated synaptic transmission. By using high-pressure-freeze (HPF) and freeze substitution (FS) EM in combination with tomography, I could show that C. elegans DPs are highly structured. DPs at cholinergic and GABAergic NMJs are branched, forming bay-like slots in which SV can usually be found docked to the AZ membrane. These bays thus may correspond to SV release sites. Large neuron-neuron synapse DPs appear to be polymers of the smaller NMJ DP unit with the same geometric arrangement of branch points and bays, indicating that DPs at functionally distinct synapses in C. elegans employ a common principle of structural assembly. To gain insights into the mechanisms that control synapse assembly, we analyzed the DP morphology in mutants lacking AZ proteins by HPF EM. Previous studies have proposed the C. elegans Liprin-α homolog synapse defective 2 (SYD-2) to be a key regulator in synapse formation by recruiting other synaptic proteins to nascent release sites. I demonstrate that SYD-2 together with a second AZ protein, ELKS-1, determines DP size in C. elegans NMJs. Whereas loss of SYD-2 results in significantly reduced DP size and inefficient vesicle recruitment, a gain-of-function (GF) mutation leads to the formation of elongated DPs. However, the ability of SYD-2 GF to promote DP elongation strictly depends on the presence of ELKS-1. A negative regulator of synapse formation, RSY-1, has recently been discovered to impair SYD-2 functionality. In this study I provide evidence indicating that RSY-1 acts as a counteracting negative regulator of DP size. I therefore implicate SYD-2/Liprin-α in the dynamic polymerization of DPs in cooperation with other regulators, rather than in the generation of DPs per se. To gain deeper insight into how axonal transport contributes to synapse assembly, I analyzed mutants with defective motor proteins known to be involved in synaptic protein transport. Kinesin-3 UNC-104 has been identified as a neuron-specific anterograde motor protein required for the transport of SVs and DCVs to synaptic sites. Loss of UNC-104 results in the accumulation of vesicles in the cell bodies. To understand if and how this transport defect affects AZ assembly, I analyzed C. elegans unc-104 mutants by confocal and electron microscopy. My initial analysis provides further evidence that the UNC-104 cargo binding domain is responsible for the attachment of SV precursors and DCVs to UNC-104. The formation of AZ DPs is, however, only moderately affected in unc-104 mutants, implying that organelles associated with AZ components may utilize alternative transport mechanisms. For the first time, I report the formation of ectopic, but functional, synapses in unc-104 mutant cell bodies. Furthermore, the vesicles accumulating in the cell bodies were characterizes as DCV-like vesicles distinct from synaptic DCVs in wild type. We suggest that these DCV-like vesicles are SV precursors that transport SV proteins to AZs, where mature SVs can then be assembled by local endocytosis.
Keywords: electron microscopy tomography; active zone; dense projection; SYD-2; liprin-α; ELKS; RSY-1; C. elegans; synaptic vesicle; neuromuscular junction; transport; UNC-104; kinesin-3; High Pressure Freezing

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Die Exozytose von synaptischen Vesikeln wird durch das komplexe Proteinnetzwerk der aktiven Zone (AZ) zeitlich und räumlich streng reguliert. Im Elektronenmikroskop ist die präsynaptische AZ durch eine elektronendichte Struktur (engl.: dense projection, DP) in ihrem Zentrum charakterisiert, die in das Zytoplasma hineinragt. Diese DP ist von einer Wolke aus synaptischen Vesikeln umgeben und spielt vermutlich eine wichtige Rolle bei der Organisation und Regulation ihrer Freisetzung. Bisher ist unser Wissen über die molekulare Zusammensetzung der DP, ihren Aufbau und ihre 3D Ultrastruktur begrenzt. Die neuromuskuläre Synapse des Nematoden Caenorhabditis elegans ist ein einfaches Modellsystem um die Struktur und Funktion der AZ bei der synaptischen Informationsübertragung zu untersuchen. Unter Verwendung von Hochdruckgefrieren und Gefriersubstitution in Kombination mit Tomographie konnte ich zeigen, dass die DP der AZ in C. elegans stark strukturiert ist. In cholinergen und GABAergen neuromuskulären Synapsen sind die DPs verzweigt und bilden Ausbuchtungen in denen synaptische Vesikel oft in engem Kontakt mit der präsynaptischen Membran vorliegen. Diese Ausbuchtungen könnten spezifische Fusionsstellen für synaptische Vesikel darstellen. Große DPs der Neuron-Neuron-Synapsen scheinen Polymere der kleineren Strukturen in neuromuskulären Synapsen zu entsprechen. Ihr geometrischer Aufbau aus Verzweigungen und Ausbuchtungen ist sehr ähnlich und deutet darauf hin, dass den präsynaptischen DPs in C. elegans ein gemeinsames Bauprinzip zu Grunde liegt. Um besser zu verstehen, welche Mechanismen den Aufbau der Synapse steuern, haben wir die Morphologie von DPs in Mutanten untersucht, denen Proteine der AZ fehlen. Frühere Studien deuten darauf hin, dass das C. elegans-Homolog von Liprin-α, synapse defective 2 (SYD-2), eine Schlüsselrolle beim Aufbau von Synapsen und der Rekrutierung von synaptischen Proteinen zu entstehenden Synapsen spielt. Ich zeige hier, dass SYD-2 zusammen mit einem zweiten Protein der aktiven Zone (ELKS-1) die Größe der DPs an neuromuskulären Synapsen reguliert. Der Verlust von SYD-2 führt zu deutlich reduzierter Größe der DPs und ineffizienter Rekrutierung von synaptischen Vesikeln, während eine verstärkte Aktivität zur Bildung stark vergrößerter DPs führt. Allerdings findet diese Vergrößerung der DPs nur in der Anwesenheit von ELKS-1 statt. Das kürzlich beschriebene Protein RSY-1 ist ein negativer Regulator der Synapsenbildung und beeinträchtigt die Funktionalität von SYD-2. In dieser Studie liefere ich Belege dafür, dass RSY-1 als negativer Gegenspieler von SYD-2 agiert und damit die Größe der DPs festlegt. SYD-2/Liprin-α ist daher zusammen mit anderen Regulatoren für die dynamische Polymerisierung von DPs verantwortlich, nicht für die Synapsenbildung per se. Um besser zu verstehen, inwiefern axonaler Transport an der Synapsenbildung beteiligt ist, habe ich Mutanten von Motorproteinen analysiert, die in den Transport von synaptischen Proteinen involviert sind. Das Kinesin-3 UNC-104 wurde bereits als neuronenspezifisches anterogrades Motorprotein identifiziert, welches für den Transport von synaptischen und elektronendichten Vesikeln zur Synapse notwendig ist. Der Aktivitätsverlust von UNC-104 führt zur Ansammlung von Vesikeln im Zellkörper der Neurone. Um zu verstehen, ob und wie der defekte Transport die Bildung der aktiven Zone beeinträchtigt, habe ich C. elegans-Mutanten für unc-104 mittels Konfokalmikroskopie und Elektronenmikroskopie untersucht. Meine ersten Analysen weisen darauf hin, dass die Domäne, die Membranlipide binden kann, verantwortlich für den Kontakt zwischen UNC-104 und Vorläufern synaptischer und größerer elektronendichter Vesikel ist. Die Bildung von DPs in der aktiven Zone ist allerdings in UNC-104 Mutanten nur wenig betroffen. Dies weist darauf hin, dass Organellen, die mit Komponenten der aktiven Zone assoziiert sind, einen anderen Transportmechanismus nutzen. Zum ersten Mal zeige ich die Bildung ektopischer aber funktionaler Synapsen in den Zellkörpern von unc-104 Mutanten. Außerdem wurden die im Zellkörper akkumulierenden Vesikel als große elektronendichte Vesikel charakterisiert, die sich von elektronendichten Vesikeln an wildtypischen Synapsen unterscheiden. Wir vermuten, dass es sich bei diesen elektronendichten Vesikeln um Vorläufer der synaptischen Vesikel handelt, welche Proteine der synaptischen Vesikel zur aktiven Zone transportieren. Dort könnten reife synaptische Vesikel durch lokale Endozytose gebildet werden.
Schlagwörter: Elektronenmikroskopie; Tomographie; Aktive Zone; SYD-2; liprin-α; ELKS; RSY-1; C. elegans; synaptische Vesikel; neuromuskuläre Synapse; Transport; UNC-104; Kinesin-3; Hochdruckgefrieren
 

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