Synaptic Ultrastructure and Regulation of Synaptic Transmission in Caenorhabditis elegans
Synaptische Ultrastruktur und Regulation der Synaptischen Transmission in Caenorhabditis elegans
von Maike Kittelmann
Datum der mündl. Prüfung:2012-06-21
Erschienen:2012-11-07
Betreuer:Prof. Dr. Stefan Eimer
Gutachter:Prof. Dr. Stefan Eimer
Gutachter:Prof. Dr. André Fiala
Gutachter:Prof. Dr. Martin Göpfert
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Format:PDF
Zusammenfassung
Englisch
The triggered release of synaptic vesicles (SVs) is tightly regulated in time and space by an elaborate network of proteins forming the active zone (AZ). When visualized by electron microscopy (EM), a morphological hallmark of the presynaptic AZ is an electron dense projection (DP) situated at the center of the AZ and extending into the cytoplasm. DPs are surrounded by a cluster of clear core SVs and have been proposed to play an important role in organizing and regulating SV release. However, our knowledge about its molecular composition, assembly mechanisms, and high-resolution 3D structure are limited. The neuromuscular junction (NMJ) of the nematode Caenorhabditis elegans provides an easily accessible model system to study AZ assembly, structure and function in regulated synaptic transmission. By using high-pressure-freeze (HPF) and freeze substitution (FS) EM in combination with tomography, I could show that C. elegans DPs are highly structured. DPs at cholinergic and GABAergic NMJs are branched, forming bay-like slots in which SV can usually be found docked to the AZ membrane. These bays thus may correspond to SV release sites. Large neuron-neuron synapse DPs appear to be polymers of the smaller NMJ DP unit with the same geometric arrangement of branch points and bays, indicating that DPs at functionally distinct synapses in C. elegans employ a common principle of structural assembly. To gain insights into the mechanisms that control synapse assembly, we analyzed the DP morphology in mutants lacking AZ proteins by HPF EM. Previous studies have proposed the C. elegans Liprin-α homolog synapse defective 2 (SYD-2) to be a key regulator in synapse formation by recruiting other synaptic proteins to nascent release sites. I demonstrate that SYD-2 together with a second AZ protein, ELKS-1, determines DP size in C. elegans NMJs. Whereas loss of SYD-2 results in significantly reduced DP size and inefficient vesicle recruitment, a gain-of-function (GF) mutation leads to the formation of elongated DPs. However, the ability of SYD-2 GF to promote DP elongation strictly depends on the presence of ELKS-1. A negative regulator of synapse formation, RSY-1, has recently been discovered to impair SYD-2 functionality. In this study I provide evidence indicating that RSY-1 acts as a counteracting negative regulator of DP size. I therefore implicate SYD-2/Liprin-α in the dynamic polymerization of DPs in cooperation with other regulators, rather than in the generation of DPs per se. To gain deeper insight into how axonal transport contributes to synapse assembly, I analyzed mutants with defective motor proteins known to be involved in synaptic protein transport. Kinesin-3 UNC-104 has been identified as a neuron-specific anterograde motor protein required for the transport of SVs and DCVs to synaptic sites. Loss of UNC-104 results in the accumulation of vesicles in the cell bodies. To understand if and how this transport defect affects AZ assembly, I analyzed C. elegans unc-104 mutants by confocal and electron microscopy. My initial analysis provides further evidence that the UNC-104 cargo binding domain is responsible for the attachment of SV precursors and DCVs to UNC-104. The formation of AZ DPs is, however, only moderately affected in unc-104 mutants, implying that organelles associated with AZ components may utilize alternative transport mechanisms. For the first time, I report the formation of ectopic, but functional, synapses in unc-104 mutant cell bodies. Furthermore, the vesicles accumulating in the cell bodies were characterizes as DCV-like vesicles distinct from synaptic DCVs in wild type. We suggest that these DCV-like vesicles are SV precursors that transport SV proteins to AZs, where mature SVs can then be assembled by local endocytosis.
Keywords: electron microscopy tomography; active zone; dense projection; SYD-2; liprin-α; ELKS; RSY-1; C. elegans; synaptic vesicle; neuromuscular junction; transport; UNC-104; kinesin-3; High Pressure Freezing
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Die Exozytose von synaptischen Vesikeln
wird durch das komplexe Proteinnetzwerk der aktiven Zone (AZ)
zeitlich und räumlich streng reguliert. Im Elektronenmikroskop ist
die präsynaptische AZ durch eine elektronendichte Struktur (engl.:
dense projection, DP) in ihrem Zentrum charakterisiert, die in das
Zytoplasma hineinragt. Diese DP ist von einer Wolke aus
synaptischen Vesikeln umgeben und spielt vermutlich eine wichtige
Rolle bei der Organisation und Regulation ihrer Freisetzung. Bisher
ist unser Wissen über die molekulare Zusammensetzung der DP, ihren
Aufbau und ihre 3D Ultrastruktur begrenzt. Die neuromuskuläre
Synapse des Nematoden Caenorhabditis elegans ist ein einfaches
Modellsystem um die Struktur und Funktion der AZ bei der
synaptischen Informationsübertragung zu untersuchen. Unter
Verwendung von Hochdruckgefrieren und Gefriersubstitution in
Kombination mit Tomographie konnte ich zeigen, dass die DP der AZ
in C. elegans stark strukturiert ist. In cholinergen und GABAergen
neuromuskulären Synapsen sind die DPs verzweigt und bilden
Ausbuchtungen in denen synaptische Vesikel oft in engem Kontakt mit
der präsynaptischen Membran vorliegen. Diese Ausbuchtungen könnten
spezifische Fusionsstellen für synaptische Vesikel darstellen.
Große DPs der Neuron-Neuron-Synapsen scheinen Polymere der
kleineren Strukturen in neuromuskulären Synapsen zu entsprechen.
Ihr geometrischer Aufbau aus Verzweigungen und Ausbuchtungen ist
sehr ähnlich und deutet darauf hin, dass den präsynaptischen DPs in
C. elegans ein gemeinsames Bauprinzip zu Grunde liegt. Um besser zu
verstehen, welche Mechanismen den Aufbau der Synapse steuern, haben
wir die Morphologie von DPs in Mutanten untersucht, denen Proteine
der AZ fehlen. Frühere Studien deuten darauf hin, dass das C.
elegans-Homolog von Liprin-α, synapse defective 2 (SYD-2), eine
Schlüsselrolle beim Aufbau von Synapsen und der Rekrutierung von
synaptischen Proteinen zu entstehenden Synapsen spielt. Ich zeige
hier, dass SYD-2 zusammen mit einem zweiten Protein der aktiven
Zone (ELKS-1) die Größe der DPs an neuromuskulären Synapsen
reguliert. Der Verlust von SYD-2 führt zu deutlich reduzierter
Größe der DPs und ineffizienter Rekrutierung von synaptischen
Vesikeln, während eine verstärkte Aktivität zur Bildung stark
vergrößerter DPs führt. Allerdings findet diese Vergrößerung der
DPs nur in der Anwesenheit von ELKS-1 statt. Das kürzlich
beschriebene Protein RSY-1 ist ein negativer Regulator der
Synapsenbildung und beeinträchtigt die Funktionalität von SYD-2. In
dieser Studie liefere ich Belege dafür, dass RSY-1 als negativer
Gegenspieler von SYD-2 agiert und damit die Größe der DPs festlegt.
SYD-2/Liprin-α ist daher zusammen mit anderen Regulatoren für die
dynamische Polymerisierung von DPs verantwortlich, nicht für die
Synapsenbildung per se. Um besser zu verstehen, inwiefern axonaler
Transport an der Synapsenbildung beteiligt ist, habe ich Mutanten
von Motorproteinen analysiert, die in den Transport von
synaptischen Proteinen involviert sind. Das Kinesin-3 UNC-104 wurde
bereits als neuronenspezifisches anterogrades Motorprotein
identifiziert, welches für den Transport von synaptischen und
elektronendichten Vesikeln zur Synapse notwendig ist. Der
Aktivitätsverlust von UNC-104 führt zur Ansammlung von Vesikeln im
Zellkörper der Neurone. Um zu verstehen, ob und wie der defekte
Transport die Bildung der aktiven Zone beeinträchtigt, habe ich C.
elegans-Mutanten für unc-104 mittels Konfokalmikroskopie und
Elektronenmikroskopie untersucht. Meine ersten Analysen weisen
darauf hin, dass die Domäne, die Membranlipide binden kann,
verantwortlich für den Kontakt zwischen UNC-104 und Vorläufern
synaptischer und größerer elektronendichter Vesikel ist. Die
Bildung von DPs in der aktiven Zone ist allerdings in UNC-104
Mutanten nur wenig betroffen. Dies weist darauf hin, dass
Organellen, die mit Komponenten der aktiven Zone assoziiert sind,
einen anderen Transportmechanismus nutzen. Zum ersten Mal zeige ich
die Bildung ektopischer aber funktionaler Synapsen in den
Zellkörpern von unc-104 Mutanten. Außerdem wurden die im Zellkörper
akkumulierenden Vesikel als große elektronendichte Vesikel
charakterisiert, die sich von elektronendichten Vesikeln an
wildtypischen Synapsen unterscheiden. Wir vermuten, dass es sich
bei diesen elektronendichten Vesikeln um Vorläufer der synaptischen
Vesikel handelt, welche Proteine der synaptischen Vesikel zur
aktiven Zone transportieren. Dort könnten reife synaptische Vesikel
durch lokale Endozytose gebildet werden.
Schlagwörter: Elektronenmikroskopie; Tomographie; Aktive Zone; SYD-2; liprin-α; ELKS; RSY-1; C. elegans; synaptische Vesikel; neuromuskuläre Synapse; Transport; UNC-104; Kinesin-3; Hochdruckgefrieren