Die Rolle der Transkriptionsfaktoren “runt-related transcriptionfactor-2“ (RUNX2) und Osterix in humanen Osteoblasten
The role of transcription factors runt-related transcription factor-2 (RUNX2) and Osterix in human osteoblasts
by Markus Giesen
Date of Examination:2008-01-24
Date of issue:2008-02-15
Advisor:PD Dr. Heide Siggelkow
Referee:Prof. Dr. Hans Jürgen Steinfelder
Referee:Prof. Dr. Gerald Wulf
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Abstract
English
Introduction: Osterix (OSX) and “runt-related transcription factor-2 (RUNX2) are transcription factors which are essential for osteoblast differentiation in-vivo during the process of bone formation. Whether their role in-vivo is reflected during human osteoblastic differentiation in-vitro as well has not been studied. Methods: Primary human osteoblasts (pHOB) cultures were established using bone chips from bone material generated during hip or knee replacement therapy. We used different models of osteoblastic differentiation to reproduce the sequence of gene expression shown in-vivo. Using RUNX2 knock down the influence of this factor on bone differentiation in-vitro was studied. Finally we investigated the gene expression of OSX and RUNX2 and its association with clinical parameters using a group of patients with metabolic bone diseases. Results: While RUNX2 gene expression was detectable in mesenchymal stem cells following osteoblastic induction, OSX was only faintly expressed. In cells growing out from bone chips the expression of RUNX2 was followed by OSX expression which decreased sharply in fully differentiated cells. In contrast, the expression of RUNX2 persisted during the entire osteoblastic differentiation sequence. Knock down of RUNX2 reduced osteocalcin expression by 87% in control cells whereas there was lower effect on OC expression in cells under osteogenic conditions. The mRNA levels of OSX used in the clinical analysis of patients with metabolic bone diseases were highly correlated to clinical and histomorphometrical parameters, whereas RUNX2 didn't correlate to any clinical parameter. Conclusion: The sequence of early osteoblast development can be reproduced in-vitro using human osteoblast models. RUNX2 down regulation in human osteoblasts was sufficient for interfering with osteoblast differentiation when grown under basal conditions. The transcription factor OSX was highly correlated to clinical and histomorphometrical factors suggesting an important role also for clinical use.
Keywords: primary human osteoblasts; siRNA; transfection; RUNX2; Osterix
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Der physiologische Knochenstoffwechsel ist
in seinen komplexen Differenzierungsprozessen noch ungenügend
verstanden. Die vorliegende Dissertation hat zum Ziel, zwei für den
Knochenstoffwechsel essenzielle Transkriptionsfaktoren, RUNX2 und
Osterix (OSX), genauer zu charakterisieren, um einen Beitrag zum
besseren Verständnis der osteoblastären Differenzierung zu leisten.
Im ersten Teil dieser Arbeit wurden die beiden osteoblastären
Transkriptionsfaktoren OSX und RUNX2 in das mit pHOB von Siggelkow
et al. (2004) reproduzierte Owen-Modell (Owen TA et al. 1990)
integriert. Dabei zeigte sich, dass RUNX2 einen konstanten
Genexpressionsverlauf und OSX mit zunehmender osteoblastärer
Differenzierung einen abfallenden Genexpressionsverlauf besitzt.
Die sich anschließende Fragestellung, welcher der beiden
Transkriptionsfaktoren im humanen System frühzeitiger exprimiert
wird, konnte im humanen Stammzell- und Primärkulturmodell erörtert
werden. Die Ergebnisauswertung hatte zum Resultat, dass RUNX2, wie
in der Literatur beschrieben, früher im Differenzierungsweg eines
Osteoblasten exprimiert wird. Im zweiten Abschnitt der vorliegenden
Promotionsarbeit stellte sich die Frage, welchen Effekt eine
achttägige Suppression einer der beiden Transkriptionsfaktoren,
RUNX2 oder OSX, auf die osteoblastäre Reifung hat. In diesem
Zusammenhang wurde die Methodik der RNA-Interferenz mit
Lipofectamine 2000 im Zellsystem mit HOS 58 und pHOB etabliert. Es
wurde der Transkriptionsfaktor RUNX2 supprimiert, da er im
Gegensatz zu OSX früher und konstanter exprimiert wird. Unter der
Suppression von RUNX2 konnte ein kausaler Zusammenhang zwischen
RUNX2 und den osteoblastären und adipozytären Markern AP, OC, OSX,
PPARy2, LPL und aP2 beobachtet werden, wobei die Genexpression der
osteoblastären Marker signifikant gehemmt und die der adipozytären
Marker signifikant induziert wurde. Eine gleichzeitig osteoblastäre
Stimulation scheint einige hemmende Effekte der Suppression von
RUNX2 insbesondere von OC zu überlagern. Die induktiven Effekte
bezüglich der adipogenen Marker blieben durch die osteoblastäre
Stimulation eher unberührt. Da die Genexpression von OSX in einigen
Patientenproben nicht nachweisbar war, befasste sich der Abschluss
dieser Arbeit mit der Fragestellung bezüglich einer möglicherweise
direkten klinischen Relevanz von RUNX2 und insbesondere von OSX, da
OSX inkonstanter exprimiert wurde. Dazu wurden sämtliche dem
Knochenstoffwechsel zugehörige serologische und
histomorphometrische Parameter in Knochenproben von insgesamt 15
Personen (Siggelkow et al. 2003) untersucht, wobei neun Personen an
verschiedenartigen Erkrankungen des Knochenstoffwechsels litten.
Die restlichen sechs Personen fungierten als gesunde
Kontrollpersonen. Beide Transkriptionsfaktoren wurden in den Proben
der erkrankten Personen hochsignifikant stärker exprimiert als in
den Kontrollproben. Die statistische Auswertung zeigte jedoch nur
für den Transkriptionsfaktor OSX signifikante Korrelationen zur
Knochendichte, zu histomorphometrischen Parametern und zu
Zytokinen, die am Knochenstoffwechsel beteiligt sind. RUNX2
korrelierte lediglich zu einem Parameter der Knochenresorption
signifikant positiv. Die erhobenen Ergebnisse deuten daraufhin,
dass OSX einen knochenprotektiven Faktor darstellt und sogar einem
Ungleichgewicht zwischen Knochenformation und Knochenresorption
durch verschiedene Expressionsmuster entgegensteuert. Insgesamt hat
die vorliegende Arbeit einen wesentlichen Teil dazu beigetragen, um
die komplexen Funktionsweisen der Transkriptionsfaktoren OSX und
RUNX2 während der osteoblastären Differenzierung besser zu
verstehen. Der Transkriptionsfaktor OSX darf zusätzlich als
möglicher klinisch relevanter Parameter registriert werden.
Schlagwörter: primäre humane Osteoblasten; siRNA; Transfektion; RUNX2; Osterix