The Molecular Architecture and Structure of the Human Prp19/CDC5L Complex and 35S U5 snRNP

Abstract

Prä-mRNA Spleißen, die zwei aufeinanderfolgenden Transesterreaktionen, die zur Entfernung des Introns und zur Ligation der Exons einer prä-mRNA führen, wird vom Spleißosom katalysiert, einer hoch dynamischen und viele Megadalton großen molekularen Maschinerie. Das Spleißosom setzt sich aus den U1, U2, U4, U5 und U6 snRNPs (small nuclear ribonucleoprotein particles) und zahlreichen zusätzlichen Proteinen zusammen, die nicht snRNP-assoziiert sind. Die Assemblierung des Spleißosoms erfolgt schrittweise und ist ein hochdynamischer Prozess. In einem ersten Schritt bindet das U1 snRNP an die 5’-Spleißstelle der prä-mRNA, gefolgt von der ATP-abhängigen Erkennung der Verzweigungspunktsequenz durch das U2 snRNP, wodurch es zur Ausbildung des prä-Spleißosoms (A-Komplex) kommt. Die Assemblierung der snRNPs auf der prä-mRNA wird durch die Bindung des U4/U6.U5 snRNPs komplettiert und führt zur Ausbildung des prä-katalytischen B-Komplexes, der allerdings immer noch keine katalytische Aktivität besitzt. Dazu bedarf es im Spleißosom zunächst umfangreicher kompositioneller und struktureller Umlagerungen, die in der Destabilisierung der U1 und U4 snRNPs kulminieren und letztlich zur Bildung des katalytisch aktivierten Spleißosoms (B*-Komplex) führen. Das katalytisch aktivierte Spleißosom ist nun in der Lage, die erste Spleißreaktion zu vollziehen, wodurch sich der C-Komplex ausbildet, der wiederum die zweite Spleißreaktion katalysiert. Nach der Katalyse der Spleißreaktionen dissoziiert das Spleißosom wieder und entlässt sowohl die gesplissene mRNA, U2 und U6 snRNPs, als auch das U5 snRNP in der Form des post-spleißosomalen 35S U5 snRNPs.

Das Spleißosom enthält zahlreiche Proteine, die kein Teil von snRNPs sind, aber trotzdem essentielle Aufgaben während des Spleißprozesses übernehmen und häufig auch in heteromeren Proteinkomplexen vorliegen. Ein solches Protein ist Prp19, ein evolutionär hochkonservierter Spleißfaktor, der für die katalytische Aktivierung des Spleißosoms benötigt wird. Prp19 liegt in der Zelle in einem heteromeren Proteinkomplex vor, sowohl in der Hefe (im sogenannten „nineteen complex“, NTC), als auch im Menschen (im sogenannten hPrp19/CDC5L-Komplex). Prp19 und Prp19-assoziierte Proteine sind Hauptkomponenten des katalytischen Kern-RNPs des Spleißosoms. Um mehr über die räumliche Architektur des humanen Prp19/CDC5L-Komplexes zu erfahren, haben wir präparative Mengen von nativem hPrp19/CDC5L-Komplex aus Zelllinien, die die hPrp19/CDC5L-Komplex-Proteine AD002 und SPF27 mit einem N-terminalem FLAG-tag stabil exprimieren, durch Affinitätschromatographie aufgereinigt. In Übereinstimmung mit vorhergehenden Daten aus unserem Labor bestehen die affinitätsaufgereinigten hPrp19/CDC5L-Komplexe aus den sieben Proteinen hPrp19, CDC5L, PRL1, AD002, SPF27, CTNNBL1 und HSP73. Eine anschließende Analyse der Stöchiometrie des hPrp19/CDC5L-Komplexes durch analytische Ultrazentrifugation, Fluoreszenzfärbung der Proteine des hPrp19/CDC5L-Komplexes nach Auftrennung durch SDS-PAGE, oder [14C]Iodoacetamid-Markierung ergab, dass der humane Prp19/CDC5L-Komplex vier Kopien des hPrp19-Proteins enthält und alle übrigen Komponenten höchstwahrscheinlich in nur einer Kopie vorliegen. Weiterhin konnte durch analytische Ultrazentrifugation ein Friktionskoeffizient für den nativen hPrp19/CDC5L-Komplex von 2,1 ermittelt werden, was darauf hindeutet, dass der Komplex eine längliche Partikelstruktur aufweist.

Im Folgenden wurde die molekulare Architektur des hPrp19/CDC5L-Komplexes durch Behandlung mit hohen Konzentrationen NaCl, NaSCN oder Heparin genauer analysiert. Durch diese Studien konnte ein hochgradig salzresistenter Kernkomplex bestehend aus hPrp19, CDC5L, PRL1 und SPF27 identifiziert werden. Des Weiteren wurden nach der Salzbehandlung auch dimere Komplexe bestehend sowohl aus AD002 und CTNNBL1, als auch aus CTNNBL1 und HSP73 beobachtet, was darauf hindeuten kann, dass diese Proteine direkt miteinander interagieren. Im nächsten Schritt wurde einerseits durch Quervernetzungsstudien mit aufgereinigten hPrp19/CDC5L-Komplexen und andererseits durch Far Western-Analyse und Pulldown-Experimente mit in vitro translatierten Proteinen ein komplexes Protein-Protein-Interaktionsnetzwerk aufgedeckt, das die hPrp19/CDC5L-Kernkomponenten, aber auch die weniger stabil gebundenen Proteine AD002 und CTNNBL1 involviert. Diese Daten konnten dann durch eine weiterführende Analyse des strukturellen Aufbaus von nativem hPrp19/CDC5L-Komplex durch limitierte Proteolyse bestätigt werden. In diesen Experimenten wurde gezeigt, dass das gesamte SPF27-Protein zusammen mit dem C-Terminus des CDC5L-Proteins und den N-Termini der PRL1- und hPrp19-Proteine einen Protease-resistenten Kernkomplex formen. Außerdem komigirieren CTNNBL1, HSP73 und der N-Terminus von CDC5L nach Proteasebehandlung und Gelfiltration, was eine direkte Interaktion zwischen CTNNBL1 und AD002 bestätigt, die auch durch Ko-Aufreinigung und Quervernetzungsexperimente bestimmt werden konnte. Daher kann davon ausgegangen werden, dass die Assoziation der weniger stabil gebundenen Komponenten an den Kern des hPrp19/CDC5L-Komplexes über die Interaktion zwischen CTNNBL1 und CDC5L vermittelt wird.

Das humane Prp19-Protein setzt sich aus drei bekannten Domänen zusammen: einer N-terminalen U-box-Domäne, einer zentralen Coiled-coil-Domäne und einer C-terminalen WD40-Domäne. Durch limitierte Proteolyse des nativen hPrp19/CDC5L-Komplexes war es möglich, die WD40-Domäne von hPrp19 zu isolieren. Nachfolgend konnte dann die Kristallstruktur dieser Domäne durch Röntgenstrukturanalyse bei einer Auflösung von 1.8 Å gelöst werden. Die WD40-Domäne von hPrp19 bildet einen kanonischen sieben-blättrigen ß-Propeller aus, in dem jedes Blatt aus vier antiparallelen ß-Faltblättern besteht.

Mit Hilfe von Negativkontrastierungs-Elektronenmikroskopie konnten wir letztlich auch die 2D-Struktur des gesamten hPrp19/CDC5L-Komplexes bestimmen. In Übereinstimmung mit den durch analytische Ultrazentrifugation erhaltenen Daten, besitzt der humane Prp19/CDC5L-Komplex eine elongierte, asymmetrische Form mit einer maximalen Ausdehnung von ~20 nm. Unter Berücksichtigung der Annahme, dass der hPrp19/CDC5L-Komplex ein hPrp19-Tetramer und Einzelkopien der übrigen Komponenten enthält, legt die asymmetrische Form des Komplexes einen asymmetrischen Assemblierungspfad nahe. Zusammenfassend beschreiben die hier erhaltenen Ergebnisse nicht nur den molekularen Aufbau des hPrp19/CDC5L-Komplexes, sondern geben auch einen ersten Überblick über mögliche Protein-Protein-Interaktionen im Zentrum des katalytisch aktiven Spleißosoms. Des Weiteren ebnen diese Studien den Weg für zukünftige funktionelle und hochauflösende strukturelle Analysen dieses essentiellen Komplexes, der einen Teil des katalytisch aktiven RNP Kerns des Spleißosoms darstellt.

Nach der Vollendung der Spleißreaktion disassembliert das Spleißosoms wieder und der hPrp19/CDC5L-Komplex dissoziiert vom Spleißosom als ein Teil des post-spleißosomalen 35S U5 snRNPs. Um mehr über die Struktur des humanen 35S U5 snRNPs zu erfahren, haben wir dieses snRNP aus HeLa-Zellen aufgereinigt, die AD002 mit einem N-terminalem FLAG/HA-tag stabil exprimieren. Eine massenspektrometrische Analyse der aufgereinigten Komplexe hat ergeben, dass sich die Proteinzusammensetzung kaum von der aus vorhergehenden Analysen bekannten Zusammensetzung unterscheidet. Unter den identifizierten Proteinen befinden sich unter anderem alle im hPrp19/CDC5L-Komplex enthaltenen Proteine, außerdem hPrp19/CDC5L-Komplex-verwandte Proteine und zahlreiche Proteine, die auch Bestandteil des spleißosomalen C-Komplexes sind. Demzufolge zeigt die Zusammensetzung des 35S U5 snRNPs eine große Ähnlichkeit zum salzstabilen RNP-Kern des spleißosomalen C-Komplexes. Eine 2D-Strukturanalyse von humanen 35S U5 snRNPs mittels Elektronenmikroskopie hat gezeigt, dass der Komplex eine trapezförmige bis dreieckige Struktur aufweist, bei einer maximalen Ausdehnung von ca. 27 nm. Darauf basierend wurde dann die 3D-Struktur des humanen 35S U5 snRNPs mit einer Auflösung von 2.4-2.8 nm rekonstruiert. Ein nachfolgender Vergleich der 3D-Struktur des 35S U5 snRNPs mit der 3D-Struktur des nativen spleißosomalen C-Komplexes, führte zur Lokalisierung von funktionell wichtigen Komponenten des spleißosomalen C-Komplexes. Demnach haben die strukturellen Informationen über den hPrp19/CDC5L-Komplex und den 35S U5 snRNP, die in dieser Studie erlangt wurden, nicht nur zur Lokalisierung der funktionell wichtigen Komponenten des katalytisch aktiven C-Komplexes beigetragen, sondern auch erste Einblicke in die molekulare Architektur eines Teils der spleißosomalen Kerndomäne ermöglicht.