Untersuchung des TGF-β-induzierten Zelltods in oligodendroglialen Kulturen

Abstract

Die Apoptose wird durch multiple Signale, integriert in komplexe Netzwerke, kontrolliert. Dabei treten verschiedene Interaktionen zwischen vielfältigen, intrazellulären Signalwegen in Bezug zu extrazellulären Reizen oder intrazellulären Beschädigungen auf. In diesem komplexen System kann der transformierende Wachstumsfaktor (engl.: transforming growth factor, TGF)-β in verschiedene Signalwege integriert sein und zeigt dabei seine starke Abhängigkeit vom Zelltyp, dem Zellkontext und weiteren umgebenden Faktoren. Das Wirkungsspektrum der TGF-βs, nicht nur in der Apoptose sondern auch im Zellwachstum, in der Migration, in der Differenzierung und Proliferation von Zellen, spiegelt die multifunktionelle Rolle dieser Zytokine wieder. Die TGF-β-induzierte Apoptose tritt sowohl in der Entwicklung als auch im adulten Organismus in vielen Organen auf, etwa zur Erhaltung der Gewebshomeostase oder zur Entsorgung geschädigter, alter und überflüssiger Zellen. Fehlfunktionen können zu schweren Erkrankungen oder Fehlbildungen führen. In neuralen Systemen spielen TGF-βs vor allem in den ontogenetischen Zelltodphasen eine wichtige Rolle. Die Identifizierung der TGF-β-involvierten Signalwege auf molekularbiologischer Ebene ist ein wichtiger Schritt zur Aufklärung dieser fundamentalen Vorgänge in einer Zelle. An dem murinen, neuralen Modellsystem, die oligodendrogliale Vorläuferzelllinie Oli-neu, wurde gezeigt, dass die TGF-β-induzierte Apoptose über den Smad-Signalweg und die Caspase-8, -9 und -3 geregelt wird. Des Weiteren wird die Expression des anti-apoptotischen Bcl-2 Familienmitgliedes Bcl-xl verringert. Eine Behandlung der Oli-neu Zellen mit TGF-β und dem Tumornekrose Faktor (TNF)-α führt zu einer Verstärkung der apoptotischen Signalwege. Weitere Signalwege oder TGF-β-vermittelte Regulationen sind nicht bekannt. Die zwei Schwerpunkte dieser Doktorarbeit waren einerseits Untersuchung zum Bcl-2 Familienmitglied Bcl-xl und dessen TGF-β-induzierte Regulation, und andererseits Analysen zur Kontextabhängigkeit von TGF-β im Bezug zu anderen Faktoren. Im Zuge dieser Doktorarbeit wurden die häufigsten pro-apoptotischen Antagonisten des Bcl-xl Proteins untersucht, die BH3-only Proteine. Die Untersuchungen ergaben jedoch für keines der bekannten BH3-only Proteine eine Regulation für Bcl-xl in der TGF-β-induzierten Apoptose in Oli-neu Zellen. Daher wurde in einer Interactomstudie, über einen GST-Pulldown, nach möglichen neuen Interaktionspartnern von Bcl-xl gesucht. Massenspektrometrische Analysen TGF-β-regulierter Kandidaten brachten Komponenten des Zytoskeletts als Bcl-xl Interaktionspartner zum Vorschein. Genauere Untersuchungen mittels Immunpräzipitationen zeigten eine Bindung des geschnittenen N-terminalen 32kDa Aktinfragments Fraktin an Bcl-xl auf. Die TGF-β-vermittelte Fragmentierung von Aktin in Fraktin war dabei abhängig von den Caspasen-2 und -8 und einem funktionstüchtigen Aktinzytoskelett. Die Fragmentierung in Fraktin war zudem eine Grundvorrausetzung für die Bindung von Fraktin an Bcl-xl. Somit ist die Fraktin-Bcl-xl Bindung ebenfalls abhängig von den Caspase-2 und -8 und dem Aktinzytoskelett. CytochalasinD, ein Inhibitor vieler Funktionen des Aktinzytoskeletts, konnte dabei die TGF-β-induzierte Apoptose in Oli-neu Zellen reduzieren. Überexpressionsexperimente mit Bcl-xl und Fraktin zeigten eine eindeutige Kolokalisierung beider Faktoren in Folge einer TGF-β Behandlung in immunzytochemischen Experimenten an. Dabei konnte eine Überexpression von Fraktin alleine keine Apoptose in den Oli-neu Zellen auslösen, bewirkte aber die Reduzierung der basalen Bcl-xl Proteinmengen und sorgte so für ein Ungleichgewicht anti-apoptotischer und pro-apoptotischer Faktoren am Mitochondrium. Dieser bisher unbeschriebene Mechanismus der TGF-β-induzierten Aktinfragmentierung und der regulierenden Fraktin-Bcl-xl Bindung konnte an primären Oligodendrozytenkulturen bestätigt werden. Versuche an der lymphozytären Zelllinie RamosB zeigten diese TGF-β-vermittelten Regulationen nicht. Auch der allgemeine Apoptose-induzierende Faktor Staurospor in konnte nicht die Bindung von Fraktin an Bcl-xl in Oli-neu Zellen vermitteln. CytochalasinD war ebenfalls nicht in der Lage die STS-induzierte Apoptose in Oli-neu Zellen zu verringern. Somit ist die Bcl-xl regulierende Bindung von Fraktin abhängig vom Zelltyp und dem Signal. Letztendlich stellt die Fraktin-Bcl-xl Bindung eine wichtige und neue Regulation des Bcl-2 Familienmitgliedes Bcl-xl in apoptotischen Vorgängen dar. Der zweite Schwerpunkt dieser Doktorarbeit waren Untersuchungen zur Kontextabhängigkeit von TGF-β. D.h. es wurden Faktoren gesucht, die neben TGF-β Apoptose in den Oli-neu Zellen auslösen können. Dabei wurde ActivinA (ActA), ein weiteres Mitglied der TGF-β Superfamilie, als Apoptose-auslösendes Zytokin ermittelt. Die apoptotische Funktion von ActA in einem neuralen Modell war bis jetzt (Stand: September 2007) nicht bekannt und erweitert die apoptotische Funktionen von Activinen. Weitere Untersuchungen ergaben, dass ActA keine Kooperation mit TGF-β eingeht. Die ActA/TGF-β-vermittelten Apoptose zeigte keine Erhöhung der Anzahl fragmentierter Zellkerne im Vergleich zu allein mit TGF-β oder ActA behandelten Zellen. Die ActA Behandlung führte auch nicht zu einer TGF-β Freisetzung. Daher wurde der ActA-vermittelte Signalweg vergleichend zum TGF-β-vermittelten Signalweg weiter untersucht. Die Analysen ergaben eine für die TGF-β Superfamilie typische Smad-Aktivierung nach ActA Behandlung. Erste Unterschiede zeigten sich bei der Überprüfung der Bcl-2 Familie und den Caspasen. Eine Involvierung der Bcl-2 Familie in der ActA-induzierten Apoptose konnte vorerst ausgeschlossen werden. Im Gegensatz zum TGF-vermittelten Zelltod waren im ActA-induzierten Zelltod allein die Initiatorcaspasen-2 und -8 signifikant aktiv. Effektorcaspasen wie die im TGF-β Signalweg relevanten Caspasen-3 und -9 spielten keine weiterleitende Rolle. Für die Kondensierung und Fragmentierung der DNA in der ActA-induzierten Apoptose konnte der Apoptose-induzierende Faktor (AIF) verantwortlich gemacht werden. Eine Hemmung der Caspasen verhinderte den ActA-vermittelten und AIF-involvierenden Zelltod und bestätigt damit neuere Studien, in denen AIF in Abhängigkeit von der Caspaseaktivität freigesetzt werden kann. Diese Summierung der Unterschiede in den ActA-vermittelten und TGF-β-vermittelten Signalwegen zeigte eindeutig die unterschiedlichen Signalweiterleitungen auf, in denen zusätzlich zwei neue Pro zesse in Bezug zur ActA-induzierten Apoptose auftraten. Einerseits wurde erstmals eine apoptotische Funktion von ActA im Nervensystem gezeigt und andererseits eine ActA-vermittelte AIF Aktivierung.