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Regulators of Ubiquitin Dependent Protein Degradation in the Filamentous Fungus Aspergillus nidulans: Insights into CsnB, DenA and CandA Function

Regulatoren der Ubiquitin abhängigen Protein Degradation in dem filamentösen Pilz Aspergillus nidulans: Einblicke in die Funktion von CsnB, DenA und CandA

by Elke Ute Schwier
Doctoral thesis
Date of Examination:2008-01-24
Date of issue:2008-02-21
Advisor:Prof. Dr. Gerhard Braus
Referee:Prof. Dr. Stefanie Pöggeler
crossref-logoPersistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-3394

 

 

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Name:schwier.pdf
Size:3.98Mb
Format:PDF
Description:Dissertation
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Abstract

English

Ubiquitin dependent protein degradation is a central mechanism regulating multiple functions in cells. Ubiquitination of target proteins requires an enzyme cascade including ubiquitin ligases (E3s). One group of E3s contains cullins as the core component. Activity of these cullin containing E3s is modulated by the covalent modification of cullin with the ubiquitin like protein Nedd8. In this work three regulators of cullin containing E3s were studied in the fungus Aspergillus nidulans. (i) The COP9 signalosome (CSN) possess an enzyme activity that deneddylates cullins. Csn2/CsnB, the second subunit of the CSN, mediates the binding of the complex to ubiquitin ligases in mammals via binding to cullin. This study shows that the fungal CsnB interacts with CulD, suggesting a conserved function of the protein. Deletion of csnB leads, like deletion of the genes for other subunits of the CSN such as csnA, csnD or csnE, to a typical csn-deletion phenotype including red pigment formation and a block in sexual development. These results support the notion that all subunits of the complex are crucial for the deneddylase function. (ii) The putative mammalian Den1 homolog of the fungus (DenA) was proven to exhibit deneddylase activity in vivo. For the first time, this deneddylase was successfully deleted in an organism. Loss of denA in A. nidulans leads to a reduction of asexual development and an increased production of sexual structures. (iii) Mammalian Cand1 binds to cullins, thereby influencing the assembly of cullin containing E3s. In Aspergilli, the corresponding gene is split into two independent open reading frames encoding the N- and C-terminal part (candA-N, candA-C) of the mammalian homolog. Deletion of the single or both candA genes leads to mutants with identical phenotypes. They produce only few asexual spores, are blocked in early sexual development and appear dark red when grown under development inducing conditions. All defects of the candA deletion mutants can be complemented by a candA-N:: C fusion construct indicating that the split is not crucial for protein functions. Only CandA-C, but not CandA-N, binds to cullins. Since both CandA proteins interact with each other, binding of CandA-N to cullin is presumably mediated by CandA-C. CandA-C is nuclear enriched and expressed in vegetative cultures but degraded at an early stage of sexual development indicating a role during onset of development. The culture filtrate of both candA and csnE deletion mutants contains orsellinic acid related substances suggesting a connection of CandA and CsnE to the regulation of secondary metabolism. This study shows that the three regulators described are crucial for fungal development, indicating that fungi are useful models to analyze the interplay between cullin containing E3 activity and differentiation.
Keywords: protein degradation; ubiquitin ligase; deneddylation; Nedd8; CSN; DenA; CandA

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Ubiquitin-abhängiger Proteinabbau ist ein zentraler Mechanismus zur Regulation verschiedenster Zellfunktionen. Ubiquitinierung von Zielproteinen benötigt eine Enzym- kaskade, zu der die Ubiquitin-Ligasen (E3s) gehören. Eine Gruppe der E3s enthält Cullin als zentrale Komponente. Die Aktivität dieser E3s wird durch kovalente Modifikation des Cullins mit dem Ubiquitin-ähnlichen Protein Nedd8 beeinflusst. In dieser Arbeit wurden drei Regulatoren von Cullin-enthaltenden E3s in Aspergillus nidulans untersucht. (i) Das COP9 Signalosom (CSN) ist in der Lage, Culline zu deneddylieren. Csn2/CsnB bindet an Culline und vermittelt in Säugerzellen den Kontakt zu E3s. Diese Arbeit zeigt, dass pilzliches CsnB mit CulD interagiert, was eine konservierte Funktion des Proteins nahelegt. Die Deletion von csnB führt, wie auch die Deletion von anderen CSN Untereinheiten wie csnA, csnD oder csnE, zu einem für csn-Mutanten typischen Phänotyp. Dieser zeichnet sich durch die Bildung eines roten Farbstoffs und eine unvollständige sexuelle Entwicklung aus. Diese Ergebnisse unterstützen die Annahme, dass alle Untereinheiten für ein intaktes CSN benötigt werden. (ii) Es wurde gezeigt, dass DenA, das A. nidulans Homolog des Den1 aus Säugetieren, in vivo Deneddylaseaktivität besitzt. A. nidulans ist der erste Organismus in dem denA deletiert wurde. Die Deletionsmutante zeigt eine verminderte asexuelle Entwicklung und die vermehrte Produktion von sexuellen Strukturen. (iii) Cand1 aus Säugern bindet an Cullin, wodurch es den Zusammenbau der E3s beeinflusst. In Aspergillen ist das entsprechende Gen in zwei unabhängige offene Leserahmen geteilt, die den N- und C-terminalen Teil (candA-N, candA-C) des menschlichen Homologs codieren. Die Deletion von einem oder beiden candA Genen führt zu Mutanten mit identischen Phänotypen. Sie produzieren nur wenig asexuelle Sporen, sind in der frühen sexuellen Entwicklung blockiert und sind dunkelrot wenn sie unter Entwicklungs-induzierenden Bedingungen angezogen werden. Da alle Defekte der candA Mutante durch die Integration eines candA-N::C Fusionskonstrukts komplementiert werden können, ist die Trennung der CandA Proteine für ihre Funktion offensichtlich nicht essentiell. Nur CandA-C, aber nicht CandA-N bindet an Culline. Da beide CandA Proteine miteinander interagieren, wird die Bindung von CandA-N an Cullin vermutlich durch CandA-C vermittelt. CandA-C sammelt sich im Zellkern an und hat vermutlich eine Funktion am Beginn der Entwicklung, da es in vegetativen Kulturen exprimiert aber zu Beginn der sexuellen Entwicklung abgebaut wird. Das Kulturfiltrat der candA und csnE Mutanten enthält Substanzen die sich von Orsellinsäure ableiten lassen, so dass sich eine Verbindung von CandA und CsnE zu der Regulation des Sekundärmetabolismus vermuten lässt. Diese Arbeit beschreibt die Wichtigkeit der drei untersuchten E3 Regulatoren für die pilzliche Entwicklung und zeigt Aspergillus als nützliches Modell zur Analyse der Wechselwirkung zwischen E3-Aktivität und Differenzierung.
Schlagwörter: Protein Degradation; Ubiquitin Ligase; Deneddylierung; Nedd8; CSN; DenA; CandA
 

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