Regulators of Ubiquitin Dependent Protein Degradation in the Filamentous Fungus <i>Aspergillus nidulans</i>: Insights into CsnB, DenA and CandA Function

Abstract

Ubiquitin-abhängiger Proteinabbau ist ein zentraler Mechanismus zur Regulation verschiedenster Zellfunktionen. Ubiquitinierung von Zielproteinen benötigt eine Enzym- kaskade, zu der die Ubiquitin-Ligasen (E3s) gehören. Eine Gruppe der E3s enthält Cullin als zentrale Komponente. Die Aktivität dieser E3s wird durch kovalente Modifikation des Cullins mit dem Ubiquitin-ähnlichen Protein Nedd8 beeinflusst. In dieser Arbeit wurden drei Regulatoren von Cullin-enthaltenden E3s in Aspergillus nidulans untersucht. (i) Das COP9 Signalosom (CSN) ist in der Lage, Culline zu deneddylieren. Csn2/CsnB bindet an Culline und vermittelt in Säugerzellen den Kontakt zu E3s. Diese Arbeit zeigt, dass pilzliches CsnB mit CulD interagiert, was eine konservierte Funktion des Proteins nahelegt. Die Deletion von csnB führt, wie auch die Deletion von anderen CSN Untereinheiten wie csnA, csnD oder csnE, zu einem für csn-Mutanten typischen Phänotyp. Dieser zeichnet sich durch die Bildung eines roten Farbstoffs und eine unvollständige sexuelle Entwicklung aus. Diese Ergebnisse unterstützen die Annahme, dass alle Untereinheiten für ein intaktes CSN benötigt werden. (ii) Es wurde gezeigt, dass DenA, das A. nidulans Homolog des Den1 aus Säugetieren, in vivo Deneddylaseaktivität besitzt. A. nidulans ist der erste Organismus in dem denA deletiert wurde. Die Deletionsmutante zeigt eine verminderte asexuelle Entwicklung und die vermehrte Produktion von sexuellen Strukturen. (iii) Cand1 aus Säugern bindet an Cullin, wodurch es den Zusammenbau der E3s beeinflusst. In Aspergillen ist das entsprechende Gen in zwei unabhängige offene Leserahmen geteilt, die den N- und C-terminalen Teil (candA-N, candA-C) des menschlichen Homologs codieren. Die Deletion von einem oder beiden candA Genen führt zu Mutanten mit identischen Phänotypen. Sie produzieren nur wenig asexuelle Sporen, sind in der frühen sexuellen Entwicklung blockiert und sind dunkelrot wenn sie unter Entwicklungs-induzierenden Bedingungen angezogen werden. Da alle Defekte der candA Mutante durch die Integration eines candA-N::C Fusionskonstrukts komplementiert werden können, ist die Trennung der CandA Proteine für ihre Funktion offensichtlich nicht essentiell. Nur CandA-C, aber nicht CandA-N bindet an Culline. Da beide CandA Proteine miteinander interagieren, wird die Bindung von CandA-N an Cullin vermutlich durch CandA-C vermittelt. CandA-C sammelt sich im Zellkern an und hat vermutlich eine Funktion am Beginn der Entwicklung, da es in vegetativen Kulturen exprimiert aber zu Beginn der sexuellen Entwicklung abgebaut wird. Das Kulturfiltrat der candA und csnE Mutanten enthält Substanzen die sich von Orsellinsäure ableiten lassen, so dass sich eine Verbindung von CandA und CsnE zu der Regulation des Sekundärmetabolismus vermuten lässt. Diese Arbeit beschreibt die Wichtigkeit der drei untersuchten E3 Regulatoren für die pilzliche Entwicklung und zeigt Aspergillus als nützliches Modell zur Analyse der Wechselwirkung zwischen E3-Aktivität und Differenzierung.