Strukturelle Charakterisierung der C-terminalen Domäne des spleißosomalen DExD/H-Box Proteins hPrp22
Strutural characterization of the C-terminal domain of the spliceosomal DExD/H-Box protein hPrp22
von Denis Kudlinzki
Datum der mündl. Prüfung:2008-01-22
Erschienen:2008-02-26
Betreuer:Prof. Dr. Ralf Ficner
Gutachter:Prof. Dr. Oli Einsle
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Format:PDF
Description:Dissertation
Zusammenfassung
Englisch
Splicing of pre-mRNA is one of the most dynamic processes in eukaryotic cells. In addition to the U snRNAs, there is a multitude of proteins involved in the splicing cycle. Some of them are mobile factors; others are integral parts of the spliceosomal complex. Most of these proteins are not directly involved in the excision of introns or the ligation of exons. Rather, they mediate protein-protein and protein-RNA contacts, respectively, or catalyze reactions, which result in internal rearrangements of the spliceosome. One class of splicing related proteins are the DExD/H-box RNA helicases. They are capable of unwinding internal base pairings between U snRNAs or unwinding U snRNA-mRNA duplexes. A noteworthy member of this protein class is Prp22, a DEAH-box protein. It was shown, that the yeast homologue of this protein has an ATP-dependent RNA-helicase activity, which is used for unwinding RNA-interactions between U5 snRNP and mRNA. This leads to the release of mature mRNA from the post-spliceosomal complex after the second transesterification step. Only then the processed genetic information is allowed to leave the cytoplasm, where finally translation at the ribosomes takes place. Within this Ph.D. thesis the three-dimensional crystal structure of the C-terminal domain of the human spliceosomal DExD/H-box protein hPrp22 (amino acids 950 - 1183) was solved. For this purpose de novo phases were determined by anomalous dispersion of bromine and selenium. The obtained crystal structure showed a new folding motif. This structure of the C-terminus of hPrp22 was subsequently used to model the homologous C-terminal domains of hPrp2, hPrp16 and hPrp43. The calculation of the electrostatic surface potentials revealed, that the different domains share a well conserved charge distribution on one half of of their surfaces, whereas opposing surfaces differ significantly in their charge distribution with respect to each other. Furthermore, numerous deletion mutants of hPrp22 and hPrp2, another spliceosomal DExD/H-box protein, were designed. Some of those protein fragments were purified and tested for ATPase activity. For this purpose a photometric enzyme linked ATPase assay was adapted, which allows for monitoring the absorption change caused by NADH decay. These experiments indicated, that the presence of the C-terminus stimulates the ATPase activity of hPrp22.
Keywords: helicase; unwinding; splicing; spliceosome
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Das Spleißen von prä-mRNA ist einer der
dynamischsten Prozesse in der eukaryotischen Zelle. Neben den
UsnRNAs ist eine Vielzahl von Proteinen am Spleißprozeß beteiligt.
Einige dieser Proteine sind mobile Faktoren, während andere
Komponenten integrale Bestandteile des spleißosomalen Komplexes
sind. Die meisten dieser Proteine sind nicht direkt an der
Entfernung der Introns und der Ligation der Exons beteiligt,
sondern vermitteln Protein-Protein- bzw. Protein-RNA-Kontakte oder
katalysieren Reaktionen, die zur internen Umlagerung des
Spleißosoms führen. Eine am Spleißen beteiligte Proteinklasse sind
die DExD/H-Box RNA-Helikasen. Sie können interne Basenpaarungen
zwischen UsnRNAs oder UsnRNA-mRNA-Basenpaarungen entwinden. Ein
Protein dieser Klasse ist das DEAH-Box Protein Prp22. Es wurde
gezeigt, dass das homologe Protein yPrp22 aus Saccharomyces
cerevisiae ATP-abhängige RNA-Helikase Aktivität zeigt, die zur
Entwindung von RNA-Interaktionen zwischen U5 snRNP und mRNA führt.
Dies führt zum Ablösen der reifen mRNA vom post-spleißosomalen
Komplex. Nur die vollständig prozessierte genetische Information
kann denn Zellkern verlassen und wird an den Ribosomen
translatiert. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde die
dreidimensionale Kristallstruktur der C-terminalen Domäne des
spleißosomalen DExD/H-Box Proteins hPrp22 (Aminosäuren 950 - 1183)
aus Homo sapiens charakterisiert. Hierzu wurden die Phasen de novo
mittels anomaler Dispersion von Brom und Selen bestimmt. Die
Kristallstruktur birgt ein neues Faltungsmotiv. Basierend auf der
Struktur der C-terminalen Domäne von hPrp22 wurden Modelle anderer
homologer C-terminaler Domänen von hPrp2, hPrp16 und hPrp43
generiert. Durch diese Modelle konnten Aussagen über die Verteilung
der Oberflächenladungen getroffen werden. Es zeigte sich, dass auf
einer Seite der verschiedenen Domänen die Ladungsverteilung
konserviert ist, während auf der gegenüberliegenden Seite
signifikante Unterschiede erkennbar sind. Weiterhin wurden
zahlreiche Deletionsmutanten von hPrp22 und hPrp2, einem weiteren
spleißosomalen DExD/H-Box Protein, entworfen. Einige dieser
verkürzten Proteinfragmente wurden gereinigt und auf
ATPase-Aktivität untersucht. Dazu wurde ein enzym-gekoppelter
photometrischer ATPase-Test angepasst. Die Absorptionsabnahme durch
NADH-Verbrauch wird dabei bestimmt. Erste Ergebnisse weisen darauf
hin, dass die Anwesenheit der C-terminalen Domäne die
ATPase-Aktivität von hPrp22 stimuliert.
Schlagwörter: Prp22; Prp2; hPrp22; DExD/H-Box; DEAD-Box; DEAH-box; RNA-Helikase; Spleißen; Spleißosom